含笑内酯衍生物ACT001对肺纤维化的治疗作用研究

李咪咪，汉京霞，孙 涛,2，刘慧娟,2

(天津国际生物医药联合研究院 1.分析测试中心，2.早期成药性评价重点实验室，天津 300457)

肺纤维化是由多种病因引起的严重肺间质慢性疾病。发病机制迄今尚未阐明，缺乏特异性治疗[1]手段。二甲基胺含笑内酯富马酸盐(DMAMCL，命名为ACT001)是由倍半萜内酯类化合物小白菊内酯经化学合成而来[2]，具有在水中易溶、原料易得、制备工艺成熟简单、成药性好的特性，目前其作为脑胶质瘤治疗药物的临床试验已经在开展。研究表明，ACT001可通过作用于IκB激酶β(inhibitor kappa B kinaseβ，IKKβ)蛋白，中等强度地抑制核转录因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)，同时提高癌细胞中的活性氧簇水平，两者均可诱导癌细胞的凋亡[3-5]。在肺纤维化过程中，NF-κB可通过促进肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-8和转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等炎症因子的基因转录而介导肺泡炎和肺纤维化[6]的发生发展；肺纤维化小鼠用抗TGF-β1[7]抗体治疗后，发现血清中细胞因子IL-4、IL-6水平明显下降，组织羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量也减少，肺纤维化被明显抑制，同时，TGF-β是上皮细胞在发生上皮-间充质转变(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程中的重要调节分子之一。有研究发现[8]，ACT001可降低类风湿关节炎小鼠淋巴结中NF-κB相关炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-17等炎症因子的表达水平；也有研究显示，ACT001可以通过降低炎症因子TNF-α的表达而对银屑病具有治疗作用。基于以上研究背景，我们推测，ACT001可能通过抑制NF-κB的活化、抑制EMT过程并且调节肺纤维化相关炎症因子的表达等发挥治疗肺纤维化的作用。

1 材料

1.1 试剂DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青/链霉素购自Gibco 公司；NIH-3T3(小鼠成纤维细胞系)购自美国ATCC；MTT购自上海生工生物；二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司；地塞米松磷酸钠、硫酸博来霉素(bleomycin, BLM)购自大连美仑生物技术有限公司；百草枯(paraquat, PQ)购自百灵威科技有限公司；羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；TNF-α、IFN-γ、TGF-β1 ELISA检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；ACT001由南开大学陈悦教授提供。

1.2 实验动物实验动物品系为SPF级昆明健康小鼠体质量(18～22) g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，实验动物使用许可证号为：0039483。

2 方法

2.1 小鼠肺纤维化模型的建立及给药治疗本研究共建立两种小鼠肺纤维化模型，诱导剂分别为百草枯(PQ)和博来霉素(BLM)。每种小鼠肺纤维化模型中，随机将60只小鼠分为2组，空白组10只，建模组50只。由PQ诱导的小鼠肺纤维化模型，建模组小鼠在建模前，提前禁食16 h，灌胃给予剂量为100 mg·kg-1，空白组用同体积的生理盐水灌胃；由BLM诱导的小鼠肺纤维化模型，建模组小鼠经气管灌注给予BLM水溶液(5 mg·kg-1)，空白组用同样方式灌注同体积的生理盐水，建模当天记为d 1。

d 7将建模组的50只小鼠随机分为5组，分别为：模型组10只、阳性药地塞米松组10只、ACT001组(设置高、中、低3个剂量组，每组10只)，♀♂各半。d 8小鼠给药治疗(给药前称重)，ACT001高(ACT001-H)、中(ACT001-M)、低(ACT001-L)剂量组每次分别按50、25、12.5 mg·kg-1剂量灌胃给药治疗；阳性药地塞米松(dexamethasone，DEX)组，按0.45 mg·kg-1剂量灌胃给药治疗，空白组及模型组小鼠按体重灌胃给予相应体积的生理盐水，给药时间为28 d。自给药之日起，每天测定各组小鼠体重，观察并记录小鼠的一般生活状态。d 39(给药结束d 2)将各组小鼠称重，然后进行摘眼球取血置于含肝素钠的EP管中，4 ℃离心机离心，4 000×g，15 min，取上清用于测定血浆中的TNF-α、IFN-γ、TGF-β1含量。取血后脊椎脱臼处死小鼠，取小鼠肺组织称重，并计算肺系数：肺系数=肺湿重(g)·体质量(kg)-1。取左肺冻存于-80 ℃冰箱中，用于进行胶原百分含量的测定；将右肺组织经10%福尔马林固定。

2.2 肺组织HYP及肺组织胶原百分含量测定精确称取肺组织湿重，放入离心管，准确加入水解液，混匀。加盖后95 °C水或沸水水解20 min，水解10 min 混匀1次，严格按照试剂盒说明书具体操作，检测肺组织HYP含量[9]。HYP百分含量/%=(样品吸光度÷标准液吸光度)×标准液浓度×稀释倍数×样品体积÷肺组织干粉重量×100%；胶原百分含量/%=HYP百分含量(%)×7.46。

2.3 组织病理学评估肺组织肺纤维化程度将固定后的各组小鼠肺组织用流水冲洗，常规脱水、制作石蜡组织切片，进行苏木精-伊红(HE)染色及Masson染色，在显微镜下观察肺组织的形态学变化以及胶原纤维含量的变化。

2.4 免疫组化石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后，放入柠檬酸缓冲液中进行高温修复，蒸馏水冲洗，10%山羊血清湿盒内封闭20 min,后滴加一系列的一抗，4 ℃摇床孵育过夜，PBS冲洗，滴加稀释的二抗(1 ∶1 000)，室温避光孵育1 h，PBS冲洗，滴加DAB显色。苏木精染核1～2 min，脱水至二甲苯，最后，将中性树胶滴在玻片组织区后盖上盖玻片，显微镜下观察拍照。免疫组化图片的评分方法：染色强度评分标准：无染色:0；浅棕黄色：+；棕黄色：++；棕褐色：+++。染色面积所占比率评分标准：1%～25%，1；25%～50%，2；50%～75%，3；>75%，4。总分=颜色深度评分×染色面积所占比率评分。

3 结果

3.1 ACT001对PQ诱导的肺纤维化模型的治疗作用

3.1.1小鼠生活状态观察和体质量变化 实验过程中，对各组小鼠的一般生活状态进行临床观察：空白组小鼠，反应灵敏，皮毛发亮、有光泽，呼吸平稳；与空白组小鼠相比，模型组小鼠精神萎靡，皮毛杂乱、无光泽，呼吸急促，体形较消瘦；ACT001各剂量组及地塞米松组小鼠精神、食欲、皮毛色泽、体重及活动情况较模型组均有所改善。同时，小鼠体重检测结果显示，给药2周后，阳性药地塞米松组及ACT001各剂量组的体重增长情况均好于模型组。给药结束后，与空白组相比，模型组小鼠的体重明显降低(P<0.01)；与模型组相比，ACT001高、中、低剂量组及地塞米松组的小鼠体重明显升高(P<0.01)。ACT001-高剂量组的体重改善情况好于地塞米松组(Fig 1A)。

3.1.2ACT001对PQ诱导的肺纤维化模型小鼠肺系数与HYP百分含量的影响 在肺纤维化的发生与发展过程中，肺系数与肺组织HYP百分含量有明显变化：与空白组相比，模型组小鼠肺系数明显升高(P<0.01)，由此可见，模型的建立是成功的；与模型组相比，ACT001-高剂量组、ACT001-中剂量组、ACT001-低剂量组及阳性药地塞米松组小鼠肺系数均明显减小(P<0.01)；与阳性药地塞米松组相比，ACT001-高剂量组小鼠肺系数低于阳性药地塞米松组(Fig 1B)。

小鼠肺组织HYP百分含量与胶原百分含量结果显示：与空白组相比，模型组小鼠肺组织HYP百分含量与胶原百分含量均明显升高(P<0.01)；与模型组相比，ACT001-高剂量组、ACT001-中剂量组、ACT001-低剂量组及阳性药地塞米松组小鼠的肺组织HYP百分含量及胶原百分含量均明显降低(P<0.01)；与阳性药地塞米松组相比，ACT001-高剂量组小鼠肺组织HYP百分含量及胶原百分含量均低于阳性药地塞米松组(Fig 1C,D)。

3.1.3ACT001对PQ诱导的肺纤维化模型小鼠肺组织病理变化的影响 HE染色(Fig 2A)及组织病理学评分(Fig 2B)结果显示：空白组肺内部结构清晰，未出现水肿、炎症及纤维化特征，肺泡腔内未发现有明显渗出物。与空白组比较，模型组肺组织结构破坏，炎性细胞浸润明显，肺泡腔明显缩小，胶原纤维和成纤维细胞大量增多，替代了肺间质，可见明显的肺间质纤维化，组织病理学评分明显升高(P<0.01)；地塞米松组肺组织炎性细胞浸润区域较模型组有所减少，肺泡炎感性程度和肺纤维化程度较模型组有所降低，但仍有较多的纤维组织增生，肺泡腔的缩小程度有所改善。与模型组相比较，ACT001各剂量组小鼠的肺组织炎性细胞浸润区域明显减少，肺组织结构较模型组也更为完整，成纤维细胞增殖减轻，肺泡炎性程度和肺纤维化程度较模型组有不同程度的降低，组织病理学评分均明显降低(P<0.01)，其中，ACT001-高剂量组效果最明显。由此可见，ACT001可以剂量依赖性的改善PQ诱导的肺纤维化程度。

Fig 1 Effect of ACT001 on body weight, lung confficient, content of hydroxyproline and collagen in PQ-induced PF mice n=10)

Masson染色结果显示(Fig 2 C,D)，空白组小鼠肺组织支气管壁的胶原层较薄，肺泡区分布有少量纤细的胶原；模型组小鼠肺组织支气管壁、肺间质和肺泡隔中胶原纤维明显增多，小血管壁及其周围，胶原分布较空白组多，支气管周围胶原增生，并延伸向肺间质、在间质沉积，肺组织局部充血水肿、可见明显的红细胞聚集，组织病理学评分明显升高(P<0.01)；与模型组比较，地塞米松组可见肺间质中支气管壁、血管壁和肺泡隔的胶原染色程度较模型组有所减轻；ACT001各剂量组肺间质中支气管壁、血管壁和肺泡隔的胶原染色及肺组织局部充血水肿现象均较模型组有不同程度的减轻。其中，ACT001-高剂量组效果最明显(P<0.01)。

3.1.4ACT001对PQ诱导的肺纤维化模型炎症因子的影响 利用ELISA试剂盒检测ACT001对血浆中肺纤维化相关炎症因子的影响，结果显示：与空白组相比，模型组的TGF-β1及TNF-α含量均升高(P<0.01)；IFN-γ含量明显降低(P<0.01)；与模型组比较，ACT001-高剂量组TGF-β1及TNF-α的含量明显降低(P<0.01)，IFN-γ水平明显升高(Fig 3)。

3.2 ACT001对BLM诱导的肺纤维化模型的治疗作用

3.2.1小鼠生活状态观察和体重变化 实验过程中，对各组小鼠的一般生活状态进行观察：空白组小鼠反应灵敏，皮毛光泽、发亮、呼吸平稳，体重逐渐增加；模型组小鼠精神不振、活动减少、皮毛枯槁、无光泽、呼吸急促、体形消瘦；ACT001各剂量组及地塞米松组小鼠精神、食欲、皮毛色泽、体重及活动情况较模型组均明显改善。同时，小鼠体重检测结果显示，给药后阳性药组及ACT001组的体重增长情况好于模型组。给药结束后，与空白组相比，模型组小鼠的体重明显降低(P<0.01)；与模型组相比，ACT001-高、中、低剂量组及地塞米松组对BLM诱导的肺纤维化模型小鼠的体重降低均有明显改善(P<0.01)(Fig 4A)。

Fig 2 Effect of ACT001 on histopathological changes in PQ-induced PF mice n=10)

Fig 3 Effect of ACT001 on content of inflammatory factors in PQ-induced PF mice n=10)

3.2.2ACT001对BLM诱导的肺纤维化模型小鼠肺系数与HYP百分含量的影响 肺系数评价结果显示(Fig 4B)：与空白组相比，模型组小鼠肺系数明显升高(P<0.01)；与模型组相比，ACT001-高剂量组、ACT001-中剂量组、ACT001-低剂量组及阳性药地塞米松组小鼠肺系数均明显减小(P<0.01)；与阳性药地塞米松组相比，ACT001-高剂量组小鼠肺系数低于阳性药地塞米松组，具有明显差异(P<0.01)。

小鼠肺组织羟脯氨酸百分含量与胶原百分含量检测结果显示：与空白组相比，模型组小鼠肺组织羟脯氨酸百分含量与胶原百分含量均明显升高(P<0.01)；与模型组相比，ACT001-高剂量组、ACT001-中剂量组及阳性药地塞米松组小鼠的肺组织羟脯氨酸百分含量及胶原百分含量均明显降低(P<0.01)；与阳性药地塞米松组相比，ACT001-高剂量组小鼠肺组织羟脯氨酸百分含量及胶原百分含量明显降低(Fig 4 C，D)。

Fig 4 Effect of ACT001 on body weight, lung coefficient, content of hydroxyproline and content of collagen in BLM-induced PF mice n=10)

Fig 5 Effect of ACT001 on histopathological changes in BLM-induced PF mice n=10)

3.2.3ACT001对BLM诱导的肺纤维化模型小鼠肺组织病理变化的影响 HE染色(Fig 5A)及病理学评分(Fig 5B)结果显示：空白组肺组织内部结构清晰，没有水肿、炎症及纤维化特征。与空白组比较，模型组肺组织结构明显破坏，炎性细胞浸润明显，肺泡腔缩小，胶原纤维和成纤维细胞大量增多，可见明显的肺间质纤维化，组织纤维化程度病理学评分明显升高(P<0.01)；地塞米松组肺组织炎性细胞浸润区域较模型组有所减少，肺泡炎性程度和肺纤维化程度较模型组有所降低，但仍有较多的纤维组织增生。与模型组比较，ACT001各剂量组小鼠的肺组织炎性细胞浸润区域明显减少，肺组织结构较模型组也更为完整，成纤维细胞增殖程度减轻，肺泡炎程度和肺纤维化程度较模型组有不同程度的降低，其中，ACT001-高剂量组及ACT001-中剂量组的组织病理学评分降低明显(P<0.01)。以上结果表明，ACT001可以明显改善BLM诱导的肺纤维化程度。

Masson染色结果显示(Fig 5 C,D)，空白组小鼠肺组织支气管壁的胶原层较薄，肺泡区仅有少量纤细的胶原；模型组小鼠肺组织支气管壁、肺间质和肺泡隔中胶原纤维明显增多，小血管壁及其周围胶原分布较空白组多，支气管周围胶原增生，并延伸向肺间质、在间质沉积，肺组织局部充血水肿、可见明显的红细胞聚集，组织病理学评分明显升高(P<0.01)；与模型组比较，地塞米松组可见肺间质中支气管壁、血管壁和肺泡隔的胶原染色较模型组有所减轻；ACT001各剂量组肺间质中支气管壁、血管壁和肺泡隔的胶原染色及肺组织局部充血水肿现象均较模型组有不同程度的减轻。其中，ACT001-高剂量组效果最明显(P<0.01)。

3.2.4ACT001对BLM诱导的肺纤维化模型炎症因子的影响 利用ELISA试剂盒检测ACT001对血浆中肺纤维化相关炎症因子的影响，结果显示(Fig 6)：与空白组相比，模型组的TGF-β1及TNF-α含量均升高(P<0.01)；IFN-γ含量明显降低(P<0.01)；与模型组比较，ACT001-高剂量组TGF-β1及TNF-α的含量明显降低(P<0.01)，IFN-γ水平明显升高(P<0.01)。

3.3 ACT001抑制肺纤维化模型小鼠EMT相关蛋白的表达本研究分析了ACT001对肺纤维化小鼠肺组织中EMT相关蛋白的影响(Fig 7)。对IHC结果进行分析，ACT001增加了上皮细胞标志物，E-cad的表达，并降低了间充质细胞标志物Vimentin的表达；同时，ACT001促进了细胞因子MMP2的表达水平。与模型组相比，ACT001可以抑制肺纤维化小鼠肺组织NF-κB的表达，并呈现剂量依赖性。这些结果显示，ACT001可以抑制NF-κB的表达，并且抑制肺上皮细胞的EMT进程。

Fig 6 Effect of ACT001 on content of inflammatory factors in BLM-induced PF mice n=10)

4 讨论

肺纤维化的主要特征为弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱，最终可导致肺间质的纤维化，是导致呼吸衰竭的主要病理基础，是一种难治愈、死亡率高的肺间质疾病。在肺纤维化模型中，百草枯和博来霉素是目前应用较多的两种肺纤维化模型的诱导剂。百草枯为联吡啶类化合物，是一种除草剂。研究显示，百草枯中毒后，肺脏是其主要靶器官。中毒5～9 d后，可见继发性损伤致肺纤维化。因而，由百草枯诱导的肺纤维化，以发病最快、最典型而被大多研究采用。目前，百草枯诱导肺纤维化，其发病机理仍不清楚。有研究称，百草枯被吸收后，机体受刺激而产生大量氧自由基，引起器官、组织、细胞的脂质氧化；也有研究称，肺泡细胞可主动摄取和蓄积百草枯，而导致严重的肺脏受损，最终导致肺纤维化。博来霉素提取自轮生链霉菌，是一种抗肿瘤药物。有研究发现，博来霉素被肺泡吸收后，可影响炎症因子的表达，诱发肺纤维化的发生。目前，由博来霉素诱导的肺纤维化的动物模型也已被普遍应用。本研究发现ACT001对上述两种模型都有一定的治疗效果。表明ACT001可能对肺纤维化过程中的脂质过氧化过程和炎症因子的产生都有一定的阻断作用。

大量间质细胞，如成纤维细胞和肌成纤维细胞的积聚和增殖，是肺纤维化的主要病理特点，多项研究表明，这些细胞是由上皮细胞发生上皮-间充质样转变转化而来[10-11]。Milara等[12]的研究也发现，无论是在肺腺癌A549细胞中，还是在特发性肺纤维化患者中，都存在EMT过程，伴随上皮细胞标志物、E-钙黏蛋白的下调及间质细胞标志物α-肌动蛋白、纤连蛋白的上调。TGF-β是EMT发生的主要调节分子之一，其通过Smad依赖性的HEY1基因来激活细胞的EMT过程[13]。也有研究发现，肺纤维化中肌成纤维细胞活化与TGF-β1/ERK/Smad3通路相关[14]。肺纤维化小鼠用抗TGF-β1抗体治疗后，体内血清细胞因子IL-4、IL-6水平均明显下降，组织羟脯氨酸(HYP)含量也减少，肺纤维化被明显抑制。本研究结果提示，ACT001可降低肺纤维化模型小鼠的TGF-β1水平，促进E-cad的表达，抑制Vimentin的表达，从而抑制EMT进程，发挥治疗肺纤维化的作用。

NF-κB是一种重要的核转录因子，在肺纤维化的发生与发展中发挥重要作用。在肺纤维化过程中，NF-κB 可通过促进炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-8和TGF-β1等的基因转录而介导肺泡炎和肺纤维化的发生与发展[15]。研究表明，牛磺酸、尼克酸、活化蛋白C等均可以通过抑制NF-κB的活化减少纤维细胞胶原的合成，减轻肺纤维化的程度[6,16]。Tong等[17]在硫酸葡聚糖诱导的炎症性肠病动物模型实验中发现，ACT001可通过抑制NF-κB的激活，降低炎性肠病的症状，降低炎症导致的肿瘤发生几率；王振华等[8]研究中发现，ACT001能降低类风湿关节炎小鼠的淋巴结中与NF-κB相关炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-17等的表达水平。本研究显示，ACT001可明显抑制细胞核内的p65的表达水平，并且随着ACT001浓度的升高，这种抑制作用也随之加强。ACT001也可降低肺纤维化模型小鼠的TNF-α、IL-4、TGF-β1水平，表明ACT001可以通过抑制NF-κB的活化来抑制TNF-α、IL-4、TGF-β1的表达水平，进而发挥治疗肺纤维化的作用。

综上所述，ACT001可以通过抑制NF-κB的活性，抑制TNF-α、IL-4、TGF-β1等肺纤维化过程中关键炎症因子的分泌并上调IFN-γ因子，从而抑制支气管上皮、肺泡上皮细胞转化为成纤维细胞和肌成纤维细胞等间充质细胞，抑制成纤维细胞的增殖、迁移及胶原合成，调节细胞外基质的代谢，从而发挥抑制肺纤维化的作用。此外，ACT001具有良好的安全性，已被作为治疗胶质母细胞瘤的孤儿药物[18]，正在进行多项临床试验(ACTRN12616000228482，澳大利亚和新西兰；ChiCTR-OIC-17013604，中国)，有望开发为治疗肺纤维化的新药。

Fig 7 Influenced of ACT001 on expression of EMT-related proteins in BLM-induced PF mice n=10)