水果风味物质的生物制备技术

孙君燕，姚凌云，宋诗清，孙敏，王化田，冯涛

（上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418）

我国水果种类丰富，果实香气怡人，浓郁的水果香气深受大众的喜爱。香气成分是水果品质的重要特征之一，水果是否受消费者喜爱，风味是重要的影响因素。但是，风味是个极其复杂的概念，它包括水果在入口前后对人的视觉、嗅觉、味觉、触觉等一系列器官刺激所形成的一种综合印象[1]。水果风味物质主要分为酯类、醛类、内酯类、萜类、羰基化合物和一些含硫化合物，这些化合物的含量会随着水果的种类和品质发生变化。

目前水果风味物质研究已成为一门新兴学科。早期水果风味物质的研究报道多见于草莓、葡萄等，通常采用蒸馏法从天然植物中制备而来，但是该方法受材料、提取条件、设备等的影响，尚不能满足大众对风味物质的需求。随着社会的发展，细胞培养、基因工程、微生物转化等生物技术制备水果风味物质逐渐成熟。鉴于此，本文对水果风味物质的生物制备技术研究进展进行了综述，旨在为今后水果风味物质的研究、开发与利用提供参考。

1 细胞培养技术

早在20 世纪50 年代，利用生物技术合成风味物质的趋势已经开始活跃，到21 世纪开始盛行。细胞培养制备风味物质方法是随着生物技术的发展而诞生的一种新型技术，此方法可以不受环境条件的影响而进行大量制备，并进行工业化生产[2]。与化学合成相比，细胞培养法更加安全，避免了金属离子和有机溶剂对食品和环境的污染[3]，但目前对细胞培养和细胞代谢途径的过程认知较为有限。根据生产手段，细胞培养技术可分为两类：微生物法和酶法；它们还可分为两大类，即利用代谢细胞在微生物发酵过程中进行合成，以及通过微生物或酶对适当前体进行生物转化[4]。

微生物发酵生产水果风味物质主要是借助微生物在有氧或无氧的条件下，制备微生物菌体，或者通过直接代谢或次级代谢产生水果风味物质。微生物发酵不仅可以改善香气成分，使水果中的不良气味消失，还可以改变水果的品质、增加营养成分，已广泛应用于食品工业中。微生物发酵是一个很有前景的生产天然风味物质的方法，目前各个行业都在试图通过发酵生产天然风味物质，主要是大量生产消费者偏爱的风味物质。如天然香兰素产品，市场需求量很大，工业生产每年需30 t 以上[5]，是世界上应用广泛的调味剂。目前以阿魏酸为直接前体，采用沙链霉菌生产香兰素的工艺已经非常成熟。萜类化合物是形成水果风味的重要物质之一，最常见的与风味相关的萜类化合物是单萜[6]。萜烯类化合物主要赋予香精油特殊的香味，是柑橘果实香气的主要成分，有一定的生理活性，如祛痰、止咳、驱虫、镇痛作用。产生萜烯化合物的菌常见于腐烂的松树上，如长喙壳属（Ceratocystic）是目前广泛研究的一类产香真菌[7]。内酯类化合物如果味、奶油味、甜味等会刺激人的味觉，其中果味指的是果香型化合物，是成熟水果散发的香气，且伴有甜味。这类化合物主要通过化学合成的方法，若采用微生物发酵法，可以生产出具有旋光特性的内酯，例如利用土壤真菌绿色木霉在简单培养基中进行细胞培养，可产生具有椰子味的物质[8]。吡嗪类化合物具有烘培或坚果的特殊风味，这类化合物是通过美拉德反应得到的，对于一些食品加工没办法进行美拉德反应的，无法获得这类特殊风味，可以利用谷氨酸棒杆菌经过发酵产生四甲基吡嗪和萜类化合物[9]，添加到食品中，可获得烘培或者坚果的特殊风味。还有一些菌可产生酯类化合物，如乙酸丁酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、酪酸戊酯，这类化合物是水果的主要风味物质。

2 基因工程

利用基因工程能够控制目的基因的表达，获取目的性状，从而得到更多种类的风味物质[10]。基因工程制备风味物质是当今食品工业上的一大趋势，通过基因工程，能让人们吃到种类丰富、风味特殊的物质。基因工程主要应用于草莓、葡萄和瓜果中，但改良果实风味成功的例子比较少，可能原因是对风味物质变化规律的研究较薄弱。科学家还利用反义基因技术并逐渐扩展到西瓜、香蕉、草莓、柑橘等，不仅可以延长果蔬的贮藏期，还可以提高果酱产率。反义基因技术原理是基于互补RNA 能形成双螺旋结构，采用人工合成或生物合成的特异性DNA/RNA片段（或其修饰产物）封闭或抑制目的基因的表达[11]。例如苑平等[12]利用农杆菌介导法将氧化酶基因的反义链导入‘翠玉’猕猴桃，延长了果实软化和风味存留的时间。

基因工程技术可以定向改变性状，这种方法便捷、易于控制，目前在微生物发酵中应用较广。在果酒的酿制中，可以利用基因工程技术，增加高级醇和酯的含量，使果酒变得更加浓郁、营养也更丰富。例如Chen YF 等[13]发现己酸乙酯是一种具有苹果风味的酯类物质，将酿酒酵母醇己酰基转移酶（ethanol hexanoyl transferase I）基因EHT1 进行了过表达，获得了高产己酸乙酯的工程菌。刘伶普[14]将编码醇酰基转移酶的基因的过表达，提高了己酸乙酯和辛酸乙酯等中链脂肪酸酯的产量。刘灿珍[15]通过基因工程，控制高级醇及乙酸酯的合成，醇类主要是异戊醇，酯类主要是辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯，改变了葡萄果酒的整体风味。张良[16]利用基因工程将烟曲霉中的柠檬酸裂解酶基因导入酿酒酵母细胞，使蓝莓汁中的柠檬酸裂解为丙酮酸，降糖快、发酵周期短，而且提高了蓝莓酒的风味。总之，基因工程技术不仅能够克服化学合成法和酶解法成本高的缺点，还能根据需要，获得目标产物，具有广阔的市场前景。

3 微生物转化

人们从水果原材料中很难提取出风味物质，这一过程受到多种因素的影响，如所需风味物质浓度低、材料的季节性变化和天气的变化无常，这些都会显著影响风味物质的产量和质量。由于生物技术的进步，提取风味物质正日益成为工业化生产的目标。风味物质生产过程中的微生物转化是指一种微生物或多种微生物将一种物质转化为另一种物质[17]，该过程需要微生物产生的酶参与反应。如果在培养基中提供特定的基质，微生物转化经过氧化、还原、水解、脱水、新C-C 键的形成，最终生产所需的风味物质。含有大量所需前体的天然来源的化合物可直接用作基质[18]，例如倍半萜是精油中提取的萜烯，是研究微生物转化最受欢迎的底物，也是橙油中较为廉价的成分[19]，具有较高的经济价值。微生物转化方法若可以广泛应用在工业上，将扩大原有物质本身的价值。

3.1 内酯类

内酯主要是指由γ-羟基酸和δ-羟基酸组成的环状酯[20-21]，有助于增加黄油味、奶油味和水果味。内酯主要是通过化学方法产生的，但与化学合成相比，微生物转化在活性成分的生产以及催化效果方面更加优秀。例如γ-癸内酯（γ-decalacton，GDL）存在于水果和发酵产品中，张婧[22]克隆格氏乳球菌的油酸水合酶，协同解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）转化油酸合成γ-癸内酯，以γ-羟基不饱和脂肪酸为底物，采用分枝孢子菌（Cladosporium suaveolens）进行生物转化生产γ-癸内酯；王萍萍[23]则利用冻土毛霉（Mucor hiemalis） 和卷枝毛霉（Mucor circinelloides）将癸酸乙酯经氧化、酸化、提取和蒸馏等步骤获得癸内酯。赵玉萍[24]采用固定化细胞转化技术，减少了底物和产物对细胞的毒性，筛选出获得高产γ-癸内酯的耶鲁维亚解脂酵母（Yarrowialipolytica），提高了γ-癸内酯的产量，对桃子香、椰子香及奶油香等香气物质的形成具有重要意义[25]。

3.2 酯类

酯是常用的调味剂，具有果香味，广泛应用于水果制品中，使产品具有水果味。乙酸乙酯与丁酸乙酯广泛存在于苹果、梨等水果中，是构成花果香气的主体成分[26]。乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸异戊酯和2-苯基乙酸乙酯被认为是葡萄酒和其他葡萄汁酒精饮料中的重要风味化合物[27-28]，它们可能是酵母菌、霉菌、细菌产生的。在酒类饮品中，脂肪酸乙酯是酿酒酵母产生的次级代谢物，其中C6-C12 的脂肪酸酯对饮品风味贡献最大。醇和酸的直接酯化主要由细菌和真菌进行，例如红曲霉能够促进己酸、丁酸及混合酸与乙醇的酯化作用，生成的酯类物质均为己酸乙酯[29]。许春艳等[30]进行单因素和正交法优化，确定最佳产酶条件，筛选出合成己酸乙酯性能较高的紫色红曲霉，为后续菌种酯化能力的研究奠定基础。

3.3 萜类

萜类化合物通常是造成精油特有气味的最重要成分，广泛存在于植物中。单萜类化合物广泛分布于自然界，具有高挥发性，是生物技术生产风味化合物的理想原料[31]。萜类化合物中，与水果风味相关的最常见的是单萜，如柠檬烯和α-蒎烯[32]。柠檬烯是柠檬的特征香气，被用作挥发性化合物转化的底物；Rottava 等[33]分离筛选出黑曲霉能够将柠檬烯转化成α-松油醇；Ferrara 等[34]发现解脂耶氏酵母可将柠檬烯转化为紫苏酸，以及一些细菌如假单胞菌也可进行生物转化。萜类化合物大多数具有苦味，但有些也具有甜味，例如甜菊苷[35]。用微生物生产单萜类物质，对果蔬风味合成具有重要的意义。

3.4 羰基

羰基存在于酮和醛中，它们呈现出独特的气味特征，有助于产生挥发性化学物质的风味属性。酮主要对奶酪风味有贡献，例如呋喃酮是草莓果实中最重要的香气成分。醛类中最常见的是苯甲醛，天然苯甲醛通常从杏仁核中释放出来，苯甲醛是仅次于香兰素的第二大挥发性物质，可以通过苯甲醇作为碳源生产苯甲醛。Sindhoora 等[36]发现甜瓜挥发物中的重要组分有酯类（27.29%）、醛类（18.57%）、杂环化合物（16.63%）。在木瓜中，醛类物质占10%左右，例如十六醛、十八醛、庚烯醛等，酮类有巨豆三烯酮、β-紫罗兰酮等。在菠萝和草莓中，2(5H)-呋喃酮具有生物活性，能够抗病毒和抗菌等[37]。4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮是具有水果香味和焦糖味的一种物质，在食品工业和化妆品中应用广泛。酮类物质通常是利用微生物代谢合成，而能代谢合成该种呋喃酮的微生物主要有鲁氏结合酵母[38]、乳酸菌[39]、毕赤酵母[40]等。

3.5 酸

具有香气的酸主要有乙酸、丁酸、己酸、癸酸、异丁酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、辛酸、苯乙酸、丙酸和戊酸。宋云花等[41]从云南乳制品分离出乳酸菌作为辅助发酵剂，添加到Cheddar 干酪的制备中，控制温度、pH，且不影响干酪的组成成分，将水果风味增加了3 倍左右。许多有价值的香料和香料组成物可以由微生物从作为前体添加的脂肪酸中产生，包括提供绿色气味的化合物、特定的内酯等。微生物发酵中，利用丁酸梭菌在厌氧的条件下可将葡萄糖转化为丁酸[42]。丁酸是具有干酪香味的物质，还可与乙醇发生酯化，生成丁酸乙酯，是具有果香味的香气成分，但该方法制备香气成分的成本高于化学合成法。

4 结论

水果深受广大消费者的喜爱，但风味物质的产生受水果原料、外界环境、栽培条件以及生物合成途径相关酶活性的影响。随着消费者对营养和美味食品需求的增加，导致人们对可能被视为天然美味材料的需求增加，可以通过生物技术解决这一系列问题。本文主要是从细胞培养技术、基因工程、微生物转化这三种生物制备技术获取水果风味物质进行探讨。采用细胞培养技术可以弥补在化学合成上存在的诸多安全风险的问题，但细胞培养由于在植物代谢过程知识上的局限，现在还存在产量低、培养环境不易控制等问题。基因工程在改善水果风味方面重要的优势是可以在特定的器官、细胞层，甚至单个细胞，通过基因转移的方式改变植物的特性，但基因工程在世界上的安全性还有待考察。微生物转化可以将低价值的物质转化成高价值的，但这一技术还不成熟。随着社会的发展及知识体系的完善，现代分离技术如超临界流体萃取技术、分子蒸馏技术的应用，以及分析仪器准确度的提高，生物技术将会在食品工业上有更广阔的应用前景。