外泌体在肝癌中的应用研究

蒋佳红，李 游，邓知敏，石媛媛，卢丹阳，杨 岚，宋炜熙，胡 琦

（湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208）

原发性肝癌是肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤，有“癌中之王”的称号，发病率居我国恶性肿瘤第5 位，是我国第4 大癌症死亡原因。尽管目前肝癌治疗手段可有效治疗早期肝癌，但由于肝癌发现晚、发展快，患者确诊时往往已到中晚期，临床仅30%～40%的患者能够在早期获得有效治疗。外泌体是一种直径40～150 nm 的胞外囊泡，含有蛋白质、脂质和RNA 等生物活性物质，其所含成分与来源细胞密切相关。近年来，许多研究证明外泌体在肝癌的发生发展进程中起关键作用，外泌体在肝癌诊断与治疗中具有重要的临床应用潜力。从外泌体入手，或可更加清晰的阐明肝癌发生发展的机制。本文将从外泌体参与肝癌发生发展的机制、用于肝癌诊断的可行性以及在中、西医治疗肝癌中的潜力三方面进行总结，以期为进一步研究及应用外泌体诊治肝癌提供参考。

1 外泌体与肝癌发生发展相关机制

1.1 外泌体与肝癌新血管形成 肝癌生长快、易转移，属于强血管依赖性肿瘤，已有研究证实肝癌细胞源性外泌体参与新生血管形成。肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）通过诱导自噬或直接形成重塑血流的微管结构对抗瘤内缺氧，并且肿瘤微环境中存在可以促进其生长的生长因子，在外泌体的作用下形成正反馈，导致不良预后。具有CSC 性质的CD90+肝癌细胞来源外泌体可传递来源细胞的lncRNA-H19，介导内皮细胞转化为促血管生成表型，并提升细胞间粘附功能[1]。抗血管生成疗法治疗后继发性的肿瘤血管形成和肿瘤生长严重限制了临床肝癌治疗效果。曾烨等[2]针对这一情况进行了模拟肝癌实验研究，发现外泌体在此过程中发挥了重要作用。血管生成抑制剂在抑制血管形成、促进人脐静脉内皮细胞自噬的同时，还诱导富血管生成因子外泌体释放，这些外泌体显著促进了内皮血管生成和肝癌血管生成。

1.2 外泌体与免疫反应 免疫抑制是肿瘤侵袭和转移的重要因素，肿瘤细胞源性外泌体通过传递肿瘤抗原和介导肿瘤免疫逃逸的相关蛋白成分，诱导T淋巴细胞凋亡、耗竭，实现肿瘤免疫逃逸。尹春来[3]发现肝癌细胞源性外泌体内有大量miRNA146a-5p，能够介导巨噬细胞向M2 型极化，导致T 淋巴细胞耗竭而加快肝癌进程。树突状细胞（dendritic cell，DC）是人体重要的抗原提呈细胞，DC 通过活化初始T 淋巴细胞，启动人类抗肿瘤特异性免疫应答，CD80 是提供T 淋巴细胞活化“第二信号”的重要分子。HepG2 肝癌细胞外泌体可降低DC 表面CD80分子的表达，并且DC 的成熟标记分子CD83 也呈低表达[4]。提示肝癌细胞外泌体可能通过诱导全身性免疫功能下降而实现肿瘤的发展和转移。肝癌细胞来源外泌体可通过多种途径作用于调节肿瘤免疫的共刺激分子，实现肿瘤免疫逃逸。程序性死亡配体-1（PD-L1）能够与表达在T 细胞表面的程序性死亡受体-1（PD-1）结合，抑制T 细胞增殖以及细胞因子分泌，负调控淋巴细胞的激活。肝癌细胞源性外泌体可与PD-1 靶向结合，PD-L1 表达上调，引起T 淋巴细胞凋亡，并抑制巨噬细胞活性，实现免疫逃逸[5]。另外，肿瘤递送的外泌体可通过STAT3 信号通路增加巨噬细胞中PD-L1 的表达和细胞因子的分泌，从而引起免疫抑制状态[6]。

1.3 外泌体与肿瘤微环境 肿瘤细胞与周围细胞的交流对恶性肿瘤的发生、发展起到重要作用，外泌体通过传递肝癌相关物质信息，调节周围细胞，改变肿瘤微环境，为肝癌细胞的生长转移创造有利环境。肝癌细胞来源外泌体通过传递miRNA-103 至内皮细胞，降低血管P120 连环蛋白、内皮型钙黏素以及闭锁小带的表达，削弱内皮连接的完整性，进而提高血管通透性并促进肝癌细胞转移[7]。癌症相关的成纤维细胞在调节肿瘤进展中起关键作用，外泌体是肝癌细胞与成纤维细胞交流的信使。已有研究表明，miR-320a-PBX3 途径通过抑制MAPK 途径的激活起到抑制肿瘤进展的作用。Li X 等[5]发现肝癌患者癌组织中成纤维细胞源性外泌体中的miRNA-320 a 表达较正常下降，与其直接下游靶标PBX3 结合减少，阻碍MAPK 信号转导通路的作用减弱，影响细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）和MMP2 的表达，从而促进细胞增殖和转移。此外，Fang T 等[8]发现肝癌细胞来源的富miRNA-1247-3 p 外泌体靶向作用于B4 GALT3，促进成纤维细胞激活并分泌IL-6 和IL-8 等促炎细胞因子，促进癌症的进展，甚至介导肝癌肺转移。

1.4 外泌体与肝癌耐药 细胞耐药性的出现降低了化疗效果，这已成为肝癌化学治疗中的难题。耐药的发生由多种机制共同参与，目前研究表明，外泌体在耐药细胞和敏感细胞之间的信号传递中发挥了关键作用。Fu X 等[9]以多药耐药细胞株和敏感细胞系为研究对象，发现耐药细胞通过外泌体将miRNA-32-5p 递送至敏感细胞，抑制PTEN 进而激活胞内磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B 途径，并且通过调节血管生成和上皮间质转化，诱导肝癌敏感细胞发生多药耐药。转化生成因子-β（TGF-β）可降低肝癌细胞对索拉非尼和阿霉素的敏感性，Takahashi K[10]发现TGF-β 在降低敏感性的同时，使lncRNAROR（长链非编码RNA)高度表达于肝癌细胞，肝癌细胞外泌体进而携带lncRNA-ROR 至周围细胞，扩大耐药细胞范围。

2 外泌体与肝癌的诊断、预后

目前，肝癌的主要诊断方法为影像学检查、血清分子标志物检测以及病理组织检查，影像学检查及血清分子标志物无法对肝癌早期诊断和微小病灶做出明确诊断；病理组织检查虽能明确诊断，但其成功率受病灶大小、穿刺进针路径等因素影响，且临床上有出血、疼痛等并发症，肝癌早期诊断仍是临床上面临的一大问题。

近年来，外泌体用于肿瘤生物标志物早期诊断已成为一大研究热点。屈振等[11]通过提取30 例肝癌患者和10 例健康体检者血清外泌体，分析发现肝癌患者外泌体miRNA-665 表达显著上升，且miRNA-665 表达程度越高，患者的临床情况越不良。尽管血清miRNA 表达水平的变化也可提示肝癌的发生，但检测灵敏度远低于血清外泌体包含的miRNA[12]。另外，外泌体检测可为评估肝癌侵袭、转移状况提供帮助。肝癌患者血清外泌体miRNA-638 表达减少与肿瘤体积、血管浸润程度、TNM 分期呈负相关[13]；血清外泌体miRNA-125 b 低水平表达的肝癌病人复发时间短，且人群总生存率较低[14]。

以上研究表明，外泌体具有成为诊断标志物的潜能。不同外泌体miRNA 表达水平的变化有不同临床的意义，部分可作为早期肝癌的诊断指标并且一定程度上可提示肝癌的病理分期，部分可提示肝癌细胞的侵袭与转移情况，且其作为肝癌生物标志物可为评估肝癌患者预后情况提供帮助。

3 外泌体与肝癌治疗

目前，现代医学治疗肝癌已有多种手段，其中以肝脏切除为治愈肝癌的主要手段，但其可行性受肝脏储备功能、余肝体积、肿瘤病理和全身情况等因素影响；此外，肝癌细胞对部分化疗药物也出现了耐药，故寻找新的肝癌治疗方法、研究提高肝癌治疗效果的方式显得尤为重要。目前研究表明，外泌体具有成为药物载体以及治疗靶点的临床应用潜能。

3.1 外泌体作为药物载体 外泌体易于从体液中提取，且具有低免疫原性、高生物渗透性和天然的靶向能力，是天然的内源性纳米载体，作为药物递送载体有很大的优势，也已成为目前研究的热点。LOU G等[15]发现间充质干细胞（adipose mesenchymal stem cell，AMSC）分泌的含miRNA-122 和miRNA-199外泌体可明显增高HUh7 肝癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性，此外将索拉非尼与含有miRNA-122 的脂肪AMSC 来源的外泌体腹腔注射于实验动物，发现索拉非尼疗效明显提高。何淑芳等[16]发现由外泌体递送的CDK1-siRNA 在细胞水平及动物水平均可有效抑制CDK1 基因的表达，具有显著的抗肿瘤效果，并且对正常的肝细胞和组织不具有毒性，可实现肝癌的安全高效治疗。以上实验研究表明，外泌体是可以定向递送内容物的高效运载体，促进调控肿瘤靶基因，具有提高疗效、减少副作用的潜在价值。周俭等[17]将外泌体作为药物递送载体的优越性应用于临床，发明了一种肝癌治疗性外泌体药物，通过预先降低或消除外泌体中促进肝癌进展的活性成分，使肝癌细胞产生的外泌体能够在不具有促癌功能的同时保留与肝癌细胞的组织亲和性，继而携载miR-26a 等miRNA 分子抑制肝癌进展。在中医理论指导下，抗肿瘤中药的多组分协同作用优于许多化疗药物，但其难溶性成分的不易吸收和无选择性分布，使抗肿瘤中药的治疗效果未能全部发挥。目前研究发现，外泌体可承载中药，将有效成分递送至靶细胞，提高中医药防治肝癌的效果。在中药活性成分姜黄素能够抑制肝癌HepG2 细胞的生长和侵袭转移能力的基础上，研究发现[18]，以外泌体作为姜黄素的药物载体，可明显提高姜黄素在体内的浓度、药物稳定性，且无明显不良反应。表明外泌体有望成为一种有效的、现代化的中药制备工艺与给药方式。

3.2 外泌体作为治疗靶点 外泌体miRNA 通过不同的机制影响着肝癌细胞的增殖、侵袭和转移，其中每一个过程都可以成为疗法的靶点。外泌体所携带的miRNA-221 可影响细胞周期调节蛋白p27kip1、p57kip2，在此基础上，切断运载miRNA-221 的外泌体可以诱导肝癌细胞出现G1 期阻滞，有效地抑制肝癌细胞的增殖活动，并阻止其克隆形成及迁移侵袭[19]。针对肝癌细胞源性外泌体可使巨噬细胞PDL1 的表达升高并介导免疫逃逸，Wu B 等[20]将未处理肝癌细胞源性外泌体和经褪黑素处理的肝癌细胞来源外泌体对照进行体内、外研究，处理组巨噬细胞PD-L1 的表达下降，且通过巨噬细胞STAT3 途径改变免疫抑制状态。以上研究表明以参与免疫抑制、肝癌细胞增殖转移的外泌体为靶点治疗肝癌，具有良好的研究与临床应用潜能。

4 总结

外泌体在肝癌发生、发展的多个环节中的作用以及应用价值是近年来的研究热点。目前，在学术理论上已经广泛认可外泌体存在于人体体液中，其所携带的miRNA 可作为肝癌诊断和预后评估的新生物标志物，并且其临床意义可能优于传统肝癌生物标志物。但外泌体所包含的miRNA 种类繁多且变化也不尽相同，如miRNA-665、miRNA-125b、miRNA-638 等数量的变化都可提示肝癌的发生，这意味着目前未明确以何种miRNA 为准来诊断原发性肝癌，变化量标准也未知。

笔者认为，局限于单一外泌体检测试验而缺乏可靠的识别与肝癌病理学特征相关的外泌体检测指标体系限制了我国临床上将外泌体应用于肝癌早期诊断，为加快将外泌体诊断潜力转变为实用效益、提高肝癌早期临床诊断率，应加强在建立外泌体检测指标体系方面的研究。

许多研究已证实外泌体是防治肝癌的潜在靶点，但迄今为止，外泌体参与肝癌发生、发展进程中的作用机制仍未完全明确，外泌体如何调节受体细胞与供体细胞的功能以及如何改造外泌体并应用于临床的研究仍较欠缺。外泌体作为药物载体在中、西医治疗中都具有增强疗效的作用，尤其是对于克服中药难溶性成分的吸收有重要作用。笔者认为，中药复方可成为中医药防治肝癌与外泌体结合研究和利用之间的联系，借助于外泌体作为药物载体的优势，加强对具有抗肝癌作用的药物、方剂的研究和利用，更好的发挥中医药优势。