瑞舒伐他汀钙片含量测定方法研究*

2020-12-16朱生良许凤清

广州化工 2020年23期

朱生良，许凤清，蒋磊

(1 合肥凯石医药科技有限公司，安徽合肥 230061；2 安徽中医药大学药学院，安徽合肥 230012)

瑞舒伐他汀钙(rosuvastatin calcium)，商品名为Crestor(美国)，可定(中国)和冠脂妥(中国香港)，是新一代的羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，能显著降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)，升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)[1]，具有强效降脂作用，临床于治疗高胆固醇血症及混合型血脂异常相关性疾病[2-4]。瑞舒伐他汀钙的相关物质及降解杂质复杂[5-6]，本文以4种常见杂质为参照，研究瑞舒伐他汀钙片HPLC测定方法，确保临床用药的有效性及安全性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters alliance e2695高效液相色谱仪，2998二极管阵列检测器，waters empower 3网络版色谱工作站，美国Waters公司；MS-105DU电子天平，瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 试药

瑞舒伐他汀钙对照品(欧洲药品质量管理局，批号：Y0001719)；瑞舒伐他汀钙杂质A对照品(TRC，批号：21-JHY-121-2)；瑞舒伐他汀钙杂质B对照品(MC，批号：170224，非对映异构体)；瑞舒伐他汀钙杂质C对照品(TLC，批号：2097-053A2)；瑞舒伐他汀钙杂质D对照品((TRC，批号：2-CRD-105-1，5S-内酯)；瑞舒伐他汀钙片自制片(批号：180711、180720，规格：10 mg)；瑞舒伐他汀钙片进口片(阿斯利康制药有限公司，批号：131408，规格：10 mg，商品名：可定)。甲醇、乙腈为色谱纯，实验用水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters CORTECS C18色谱柱(50 mm×4.6 mm，2.7 μm)；流动相A为0.01 mol/L乙酸铵水溶液(用三氟乙酸调pH值至3.5)，B为乙腈，梯度洗脱(0～13 min，24%～36% B；13～17 min，36%～38% B；17～20 min，38%～62% B；20～25 min，24% B)；体积流量：0.6 mL·min-1；检测波长：242 nm；柱温40 ℃，进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

取瑞舒伐他汀钙对照品26 mg，精密称定。置100 mL棕色量瓶中，加乙腈25 mL，振摇，待溶解后加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；取储备液适量加乙腈-水(25:75)制成每1 mL约含0.05 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取本品10片，置1000 mL棕色量瓶中，加250 mL乙腈和等量的水振摇超声使溶解，再加水稀释至刻度，超声15 min，摇匀，放冷至室温，过滤，弃去初滤液3 mL，取续滤液适量用乙腈-水(25:75)稀释制成每1 mL约含0.05 mg的溶液，0.22 μm滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.4 系统适用性试验

称取瑞舒伐他汀钙对照品25 mg和杂质A、B、C、D各2.5 mg，精密称定，置100 mL棕色量瓶中，加乙腈-水(25:75)适量超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，取5 mL置25 mL棕色量瓶中，加乙腈-水(25:75)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液。同法配制单个杂质对照品定位溶液。取上述溶液，照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)按上述“2.1”项下色谱条件在242 nm波长处测定，分别各取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。瑞舒伐他汀峰与瑞舒伐他汀非对映异构体峰(杂质B)的分离度应大于1.5，瑞舒伐他汀峰的拖尾因子应小于1.2，理论塔板数不得低于10000。色谱图见图1。

图1 瑞舒伐他汀钙及杂质A、B、C、D对照品单个溶液及混合溶液HPLC图

2.5 检测波长的选择

取本品标准曲线项下中间浓度的对照品溶液在二极管检测器上检测的210～400 nm波长范围内扫描图可知，本品在流动相中在241.5 nm处有最大吸收峰，同时参照本品已有国内外瑞舒伐他汀钙原料和片剂标准含量测定波长多为242 nm，故本品HPLC法也采用242 nm作为含量测定的检测波长。

2.6 线性关系考察

精密吸取对照品储备液适量置25 mL棕色量瓶中，分别加乙腈-水(25:75)配成含瑞舒伐他汀30、40、50、60、70 μg·mL-1的对照品溶液，摇匀。照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)在242 nm波长处测定，流动相和梯度条件同上“2.1”项下，进样10 μL，记录色谱图。以对照品质量浓度(μg·mL-1)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制回归曲线，回归计算方程为Y=40795.19X+22306.72(r=0.9997，n=5)。结果表明，瑞舒伐他汀对照品溶液在30.01～70.03 μg·mL-1的浓度范围内，其浓度与峰面积呈良好的线性关系，截距与标示浓度响应值百分比(B/Y%)为1.08%，小于2.0%，符合要求。

2.7 精密度试验

取上述“2.6”项下中间浓度的对照品溶液，按照上述“2.1”项下色谱条件测定，连续进样 6 次，记录色谱图，考察主峰峰面积和保留时间的变化情况，考察仪器精密度。可接受标准：RSD≤1.0%[7]。结果，峰面积和保留时间的RSD%分别为0.172%和0.028%，符合要求，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

按“2.4”项下供试品溶液制备方法，配制6份相同浓度的供试品溶液，按照“2.1”色谱条件测定，记录色谱图。同时用对照品溶液进行对照测定，按外标法以峰面积计算6份供试品溶液中含量的相对标准偏差，考察方法的重复性。可接受标准：RSD≤1.0%。结果，含量平均值为99.67%，RSD=0.42%，法重复性良好。

2.9 中间精密度实验

对同一批次的瑞舒伐他汀钙片(批号：180720)，在同一实验室，分别在不同时间、不同仪器上，由不同实验员操作，各平行配制6份，测定含量，对数据检测结果进行统计分析，计算所得12个含量数据的相对标准偏差，验证其中间精密度。可接受标准：RSD≤1.0%。按上述“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述“2.1”项下色谱条件测定。结果，12个含量数据平均值为 99.35%，RSD=0.66%。表明该方法中间精密度良好。

2.10 稳定性实验

按上述“2.3”项下方法制备供试品溶液，室温放置 0，1，2，4，6，8 h按照上述“2.1”项下色谱条件测定，记录瑞舒伐他汀钙峰面积。结果，峰面积RSD=0.08%。表明，瑞舒伐他汀钙片含量测定供试品溶液在8 h内稳定。

2.11 回收率试验

精密称取空白辅料适量，精密加入一定量的瑞舒伐他汀钙原料，按上述“2.4”项下供试品溶液制备方法操作(等比例缩小10倍)，使最终的样品中含有的瑞舒伐他汀钙(折干折纯)浓度为标示浓度的80%，100%，120%，每个浓度平行操作3份。混合均匀，按上述“2.1”项下色谱条件测定，考察检测方法的准确度。范围：工作浓度的80%～120%。可接受标准：回收率应在98%～101%，RSD≤2.0%。实验结果表明本法回收率较好，辅料对测定方法基本没有影响。结果见表1。

表1 回收率试验结果(n=3)

2.12 定量限实验

取瑞舒伐他汀钙对照品适量，用乙腈-水(25:75)逐步稀释配制成一系列浓度的溶液，调试色谱仪，待基线平稳后精密量取不同浓度的对照品溶液各10 μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以信噪比为10:1作为本品定量限，并记录色谱图；结果本品的定量限浓度为0.077 μg·mL-1，约相当于含量测定供试品浓度的0.15%。

2.13 耐用性实验

实验考察了不同柱温、不同流速、不同流动相初始比例、流动相 A 的不同 pH值条件、缓冲盐浓度和3种不同厂家的液相色谱仪，计算瑞舒伐他汀钙的含量，验证该方法的耐用性。可接受标准：RSD≤2.0%。结果表明柱温在±2 ℃范围变化、流速在±0.05 mL·min-1范围变化、流动相比例在±1范围变化、流动相A的pH值在± 0.1范围变化、缓冲盐浓度±10%范围变化，以及变更Waters Arc、赛默飞U3000、Waters 2695和安捷伦1260等3个厂牌4种型号的液相色谱仪，瑞舒伐他汀钙含量稳定，RSD均小于1.0%，符合规定。表明该含量测定方法的耐用性良好。虽然改变流速、柱温和流动相初始比例时，对主峰的保留时间影响较大，但不影响本品含量和杂质与主峰的分离度以及其他已知杂质分离度，说明本色谱条件耐用性较好。

2.14 样品的含量测定

按上述“2.4”项下的供试品溶液及“2.2”项下的对照品溶液的配制方法，分别配制180720批样品溶液和对照品溶液，各进样10 μL，按上述“2.1”项下的色谱条件测定。按外标法以峰面积分别计算样品中的瑞舒伐他汀钙的含量，平行3 份，结果分别为100.01%、99.31%和99.90%，平均值为 99.74%，RSD 为0.38%。见图2。

图2 瑞舒伐他汀钙片HPLC色谱图

3 讨论

3.1 流动相的选择

考察了1%三氟乙酸溶液-乙腈、水-甲醇-乙腈、0.01 M乙酸铵溶液-乙腈和0.02%三氟乙酸溶液-乙腈等四种流动相系统，结果水-乙腈-0.01 M乙酸铵溶液能使瑞舒伐他汀钙与杂质B(非对映异构体)和杂质A得到基线分离，且能够有效检出杂质C、D和2个光降解杂质，峰型较好，各峰出峰时间早。因此，最终选择流动相0.01 mol·L-1乙酸铵溶液(用三氟乙酸调pH值至3.5)-乙腈系统梯度洗脱达到目标产物与杂质基线分离。

3.2 系统适用性溶液的制备

因瑞舒伐他汀钙在pH 1.0盐酸溶液不稳定，降解生成瑞舒伐他汀非对映异构体(杂质B)、瑞舒伐他汀-5S-内酯(杂质D)和瑞舒伐他汀-5R-内酯，后两者经碱中和处理后重新生成主成分及杂质B[3]。实验过程中，取瑞舒伐他汀钙对照品2.6 mg置50 mL棕色容量瓶中，加入1%的三氟乙酸25%乙腈溶液10 mL，摇匀，置50 ℃水浴加热1 h，放冷，加入1 mol·L-1氢氧化钠溶液1.5 mL，摇匀，此溶液含有主成分和杂质B，再加入杂质A、C、D，用乙腈：水(25:75)配制成系统适用性溶液，此溶液杂质峰检出明显，更有利于考察色谱条件的分离效果和其他杂质的检出情况，确保样品中含有的杂质成分在含量测定条件下能够完全分离和洗脱，避免多次进样后鬼峰和馒头峰的出现，确保含量测定结果的准确性。

3.3 供试品制备方法选择

瑞舒伐他汀钙见光不稳定，实验过程中发现本品在紫外光365 nm、阳光和自然光条件下均有两个光降解杂质峰产生，而在白炽灯和棕色瓶避光条件下均无光照峰产生(图3)，依据光降解试验结果供试品需避自然光操作或采用棕色瓶配制。另外采用原进口标准的方法对可定片(131408)研细后配制供试品测定结果偏低(95.44%)，而整片投料后配制供试品测定结果(99.23%)符合要求。故本品含量测定供试品配制应采用整片投料，棕色瓶避光操作。根据本品有关物质项下的研究结果显示，杂质D在甲醇溶液中易降解生成杂质D-甲酯峰，故本品供试品配制溶剂不宜选择甲醇，应采用不含醇羟基的乙腈水溶液进行配制，也进一步验证本品处方工艺研究不宜采用含醇的湿法制粒压片工艺，而应采用粉末直接压片工艺。

图3 光降解试验HPLC图谱

3.4 色谱柱的选择

本实验采用短的细粒径色谱柱，与国内外标准(EP9.0原料标准和进口片剂标准JX20030283)使用长150 mm或250 mm的粗粒径色谱柱相比(最后一个杂质D出峰在40～50 min)，具有出峰时间快(最后一个杂质D出峰在14～18 min)、分离效果好、柱效高的特点，大大缩短了分析时间，节省了溶剂；另实验中比较了不同厂家不同品牌的细粒柱，按“2.4”项下系统适用性实验进行杂质峰与瑞舒伐他汀钙分离度考察。结果，沃特世色谱柱分离效果强，各降解峰均能检出，降解物与主成分分离度符合规定。为保证方法的准确、可靠，本实验规定采用Waters CORTECS(50 mm×4.6 mm，2.7 μm)进行含量分析。