不同提取及测定方法对中药紫草组方抗氧化性比较*

王循浩，尹楠翔，李 倩，顾蕴钰，张春平

(1 徐州医科大学临床医学系，江苏 徐州 221004；2 徐州医科大学药学院，江苏 徐州 221004)

中药紫草的药理价值已得到广泛的应用，如消炎[1]、抗菌[2]、止血[3]、抗病毒[4]、抗肿瘤[5]、免疫调节[6]等，但中药的应用讲究互相调和和合理配伍[7]，《神农本草经》中提出“上药一百二十种为君，主养命；中药一百二十种为臣，主养性；下药一百二十五种为佐使，主治病；用药须合君臣佐使”。为了使紫草能有更好的临床疗效，本实验在传统紫草单一应用的基础上结合其他传统中药探讨紫草为主的中药组方的抗氧化作用，进一步分析紫草的临床价值。但目前对紫草抗氧化性的测定多是采用的单一紫草提取物作为药液，而对于紫草组方的分析少有报道。本实验通过DPPH法和PTIO法比较了两者的抗氧化性，同时讨论了两种组方、不同药液浓度及去离子水和无水乙醇两种提取媒介对其自由基清除效果的影响。实验表明紫草中药组方相对于单一紫草而言不仅有更好的抗氧化作用，其应用价值也更加广泛，且通过去离子水的提取物抗氧化效果更佳。因此，本实验有望能为紫草的拓展应用找到一条更全面更有效的途径。

1 材料与仪器

1.1 中药材料

组方1：软紫草20 g、血竭12 g、乳香4 g、没药4 g、黄芪6 g、当归8 g、防风4 g、生地4 g、黄连4 g、苦参4 g、大黄4 g、金银花4 g、地榆4 g、红花4 g，共计86 g；

组方2：软紫草20 g、血竭12 g、乳香4 g、没药4 g、黄芪6 g、当归8 g、防风4 g、生地4 g、黄芩4 g、黄柏4 g、大黄4 g、白芷4 g、牡丹皮4 g、丁香4 g，共计86 g。

1.2 试 剂

无水乙醇，上海凌峰化学；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，Sigma；3-氧代-2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧，Sigma；磷酸二氢钾，上海凌峰化学。

1.3 仪 器

N1300D-WB旋转蒸发仪，东京理化；UV-2550紫外分光光度计，岛津。

2 实验方法

2.1 提 取

按上述配方称取组方中的中药组方1和组方2各两份，分别放入4个500 mL的圆底烧瓶中。每个组方的烧瓶中分别加入适量无水乙醇和去离子水直至所有药材都被浸泡在内。将放有药品的500 mL圆底烧瓶放入电热套内，用电热套进行加热，控制温度使其保持微沸并持续2 h。加热结束后取出提取液之烧杯中，再次向圆底烧瓶中分别加入适量无水乙醇和去离子水，再次加热2 h，加热完成后，去除药渣，保留液体提取物倒入烧杯中并混合两次提取物。至此，应获得4组提取液，分别为组方1醇提物、组方1水提物、组方2醇提物、组方2水提物。

2.2 浓 缩

将提取物放入1000 L的圆底烧瓶中，利用旋转蒸发仪分别将无水乙醇和去离子水蒸出，使药液逐渐浓缩，直至烧瓶内的药液变稠。将浓缩后的药液倒入小烧杯中，分别用无水乙醇和去离子水定容至50 mL，最后获得四组提取物浓缩液。

2.3 抗氧化测定DPPH法

DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，DPPH自由基有单电子，在520 nm处有一强吸收峰，其醇溶液呈紫色。抗氧化剂能使单电子配对，从而使A520 nm值降低，溶液褪色。由于这种颜色变化与其接受电子数量成定量关系，因而可在517 nm处测定其吸光度据此判断自由基的清除情况，从而评价实验药液的抗氧化能力，此能力用清除率表示，清除率越大，抗氧化能力越强[8]。

配制DPPH溶液：分析天平称取DPPH 0.0250 g，加无水乙醇用容量瓶定容至50 mL，得0.5 g/L DPPH溶液50 mL，用移液管移取上述溶液10 mL，无水乙醇稀释至100 mL，得0.05 g/L DPPH溶液。

配制样品液：分别将0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、1.2、1.5 mL的药液用无水乙醇稀释至50 mL获得样品液。

表1 DPPH法抗氧化性测定实验分组

按上述表格在试管中分组加入相应试剂后避光反应，分别在30 min和60 min后用分光光度仪在517 nm处测量吸光度。平行实验3次。按下述公式计算清除率：

2.4 抗氧化测定PTIO法

PTIO自由基有单电子，在557 nm处有一强吸收，其水溶液呈紫色。抗氧化剂能使单电子配对，从而使 A557 nm值降低，溶液褪色。由于这种变化其接受电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行测量。PTIO的自由基稳定性比DPPH更强，为了较好的实验效果可以加热或延长反应时间[9]。

配制样品液：分别将0.0625、0.125、0.25、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4 mL的药液用无水乙醇稀释至50 mL获得样品液。

配制pH 7.4的PBS溶液：取磷酸二氢钾1.36 g，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液79 mL，用水稀释至200 mL，配制好之后低温储藏[10]。

配制PTIO的PBS溶液：分析天平称取PTIO 0.0250 g，加PBS溶液定容至50 mL。移液管移取储备液10 mL，加PBS至100 mL，得0.05 g/L PTIO的PBS溶液。

表 2 PTIO法抗氧化性测定实验分组

按上表将溶液配置好加入试管后，封口放入37 ℃恒温箱中反应2 h。之后用分光光度仪在557 nm处测定吸光度，平行试验3次，按下面的公式计算供试药液PTIO自由基清除率：

3 结果与讨论

3.1 DPPH法结果

实验表明：以药液量0.5 mL为例实验数据如下，组方1(水提、反应30 min)清除率为91.91%，组方2(水提，反应30 min)清除率为91.69%，组方1(醇提，反应30 min)清除率为68.9%，组方2(醇提，反应30 min)清除率为92.68%，组方1(水提，反应60 min)清除率为91.69%，组方2(水提，反应60 min)清除率为91.82%，组方1(醇提，反应60 min)清除率为74.84%，组方2(醇提，反应60 min)清除率为94.65%。分析如下：以去离子水为溶剂提取的药液与DDPH反应，60 min组的自由基清除率与反应30 min组无明显差别，组方1与组方2无明显差别；以无水乙醇为溶剂提取的药液与DPPH反应，60 min组的自由基清除率高于反应30 min组，组方2的清除率大于组方1；从两种提取溶剂方面比较可以发现，同等量的药液，组方1用去离子水提取获得的药液抗氧化性明显优于用无水乙醇提取所获得药液。组方2用无水乙醇提取所获得药液略优于用去离子水提取获得的药液。

图1 DPPH法组方抗氧化性测定结果

3.2 PTIO法结果

数据表明：以0.5 mL药液为例数据如下：组方1(水提，37 ℃，2 h)清除率61.92%，组方2(水提，37 ℃，2 h)清除率66.23%，组方1(醇提，37 ℃，2 h)清除率27.42%，组方2(醇提，37 ℃，2 h)清除率44.03%。分析如下：通过PTIO法测定的自由基清除表明，用去离子水为溶剂提取的组方2药液抗氧化能力略优于组方1，用无水乙醇为溶剂提取的组方2药液抗氧化能力略优于组方1，从两种提取溶剂角度比较同等药液量前提下，以去离子水为溶剂提取的药液抗氧化能力较强。

图2 PTIO法组方抗氧化性测定

3.3 用DPPH法和PTIO法测软紫草的自由基清除率

按上述方法称量86 g软紫草，以上述方法提取、浓缩、定容后获得药液，再用DPPH和PTIO法测量其自由基清除率。结果表明：根据DPPH法测定的软紫草提取物自由基清除率数据表明，以去离子水或是无水乙醇为溶剂进行提取对软紫草提取物的抗氧化性并无明显的影响。

图3 DPPH法紫草抗氧化性测定

根据PTIO法的测量结果表明醇提物的自由基清除率高于水提物。但在实验过程中发现，当样品浓度逐渐增高时，PTIO法测得的自由基，清除率数据愈发不稳定，测量结果的准确性下降。

图4 PTIO法紫草抗氧化性测定

4 结 论

本实验通过DPPH、PTIO两种方法测定了以软紫草为主的中药组方的抗氧化能力，并考察了以去离子水和无水乙醇为溶剂的两种提取方式对其自由基清除能力的影响，实验数据表明，在以这个中药组方作为原料进行提取时，以去离子水为溶剂进行提取所获得药液其抗氧化能力更强，且本实验给出的两种组方中，组方2的抗氧化性能高于组方1。在单纯软紫草提取时，本实验提取所用的溶剂并不影响它的抗氧化性。因此在实际应用中药组方时，应当选择合适的提取方法以发挥最大的药用价值[11]传统紫草用于临床时，通常发挥其抗炎、止血等功效，但用于外伤时，单纯的紫草提取物对伤口的愈合作用有限，跟据传统中医的用药观念，君一臣二，制之小也。君二臣三佐五，制之中也。君一臣三佐九，制之大也。根据“君臣佐使”配合用药在临床上常有更好的疗效[12]，本实验的分析数据也表明，将紫草作为君药配成中药组方并不会影响其抗氧化能力，并且因为组方用药赋予了其更加广泛的应用前景，如皮肤烧伤、压疮等外伤的治疗方面，在发挥抗炎抗菌作用的同时，也起到了去腐生肌、镇痛等作用[13]，还有可加快创面的愈合，减轻患者的痛苦和经济负担，无不良反应等优势[14]。因此在临床应用中，中药组方相较与单一中草药有更广泛的应用价值。