非人类免疫缺陷病毒感染的耶氏肺孢子菌肺炎患儿13例病例系列报告

段袁园 金丹群 许愿愿 童文佳

耶氏肺孢子菌(PJ)又称卡氏肺孢子菌(PC)，是肺部机会性致病菌。以往报道，PJ肺炎(PJP)常发生于人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者，尤其是外周血CD4+细胞计数<0.2×109·L-1者[1]。近年来，由于采用高效抗反转录病毒治疗AIDS，且随着免疫抑制剂在器官移植、肿瘤化疗和自身免疫疾病等患者中的广泛应用，PJP发病率在AIDS患者中显著下降， 而在非AIDS人群中呈上升趋势[2]。AIDS患者合并PJ感染的潜伏期约为4周，以亚急性发病为主。非AIDS患者合并PJ感染的潜伏期约为2周，病程进展速度较快，易出现呼吸衰竭，病死率高[3]。目前有关成人PJP的报道较多，儿童的相关报道较少。本文回顾性分析了安徽省儿童医院(我院)近年来收治的非HIV感染PJP患儿的临床资料。

1 方法

1.1 PJP的诊断标准 (1)有发热、气促、咳嗽、呼吸困难、紫绀等症状；(2)肺部影像学检查以磨玻璃影为主，还可表现为铺路石征、肺气囊征、支气管血管束长索条征等；(3)以下任意1项病原学检查阳性：①痰或支气管肺泡灌洗液镜检发现PJ包囊，②PCR检测PJ-DNA >103拷贝·mL-1，③肺泡灌洗液或血清标本病原学宏基因组测序PJ阳性。

1.2 病例纳入和排除标准 纳入2014年8月1日至2019年7月31日我院PICU确诊PJP并接受治疗的连续病例。排除满足以下任意1项者：①HIV阳性；②临床诊断PJP、病原学检查阴性的病例。

1.3 资料截取 患儿的性别、年龄、基础疾病，临床症状和体征，实验室检查结果，影像学检查资料，既往糖皮质激素或其他免疫抑制剂的使用时间，病原学检查结果，PJ感染相关的症状开始出现到使用甲氧苄胺嘧啶-磺胺甲基异噁唑(TMP-SMZ)的时间，随访情况。

需要说明的是，本文WBC、CRP、淋巴细胞相关指标截取入PICU 24 h内的检查结果，LDH、(1,3)-β-D-葡聚糖(BDG)截取入PICU后最高值(每周检测2次)，PF指数截取住院期间的最差结果；对影像学原始资料进行重新读片。

1.4 病原学检测 留取患儿深部痰/支气管肺泡灌洗液，加等体积无水乙醇离心沉淀，用PBS-EDTA缓冲液重复漂洗后4 ℃保存。

1.4.1 PJ的检测方法 六胺银染色：采用六亚甲基四胺银染色法(染色液购自河南赛诺特生物技术有限公司)。在油镜下观察，PJ包囊呈圆形、椭圆形或月牙形，囊壁染成棕色或黑褐色。若囊内小体逸出，空囊形成括弧样结构，为六胺银染色阳性。

六胺银染色结果阴性的可疑患儿，提取标本的基因组DNA(美国Promega公司DNA提取试剂盒)，以此为模板进行巢式PCR(美国MBI公司Taq酶和dNTP)，扩增后对PJP的ITS1-5.8s rDNA、ITS2基因进行测序和基因型分析。

宏基因测序，将患儿血清或肺泡灌洗液标本解冻，经过几次洗脱，抽提总DNA后用Qubit 2.0定量，illumia NextSeq测序仪测序(广州赛哲生物科技股份有限公司)。去除低质量测序序列后，首先比对到人类参考基因组，余序列比对到NCBI数据库中，数据结果按照细菌、病毒、真菌和寄生虫进行分类和排列。

1.4.2 其他病原体的检测 连续2次痰液或2份不同部位的血培养均提示为同一细菌，定义为阳性结果；常规送检巨细胞病毒(CMV)抗体及CMV-DNA检测，血浆CMV-DNA≥500拷贝·mL-1，定义为CMV感染。

1.5 随访 入PICU后90 d时，随访存活患儿的肺部CT。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以xˉ±s表示，组间比较采用t检验，非正态分布的计量资料以中位数(最小值，最大值)表示，组间比较采用秩和检验；计数资料组间比较采用Fisher 确切概率法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 研究期间我院临床诊断PJP 18例，其中1例HIV阳性，4例病原学检查阴性，余13例PJP患儿进入本文分析。 13例中，六胺银染色镜检发现PJ包囊4例，PCR检测PJ-DNA >103拷贝·mL-15例，宏基因测序检出PJ 4例(3例为肺泡灌洗液标本、1例为血清标本)。

2.2 临床特征 表1显示，13例中，男7例、女6例，发病年龄(80.8±23.8)月。基础疾病：原发性肾病综合征4例，先天性免疫缺陷病和血液肿瘤各2例，实体瘤、IgA肾病、幼年型皮肌炎和免疫性血小板减少症各1例，例5未发现相关基础疾病(多次行淋巴细胞亚群、免疫球蛋白抗体检测等未见异常，全外显子基因测序未发现免疫缺陷相关的基因异常)。发热12例，气促11例、咳嗽10例(干咳8例，咳痰2例)，纳差/体重减轻9例，进行性呼吸困难8例，呻吟5例，2例肺底可闻及固定湿啰音。

10例发病前使用免疫抑制剂。本次感染相关症状出现后，均使用抗生素治疗，11例同时或先后使用≥2种抗生素均无效。13例均因出现呼吸衰竭转入PICU。

13例患儿中，LDH均升高，8例BDG升高。13例均在高度怀疑或确诊PJP后给予TMP-SMZ治疗， TMP 15～20 mg·kg-1·d-1、 SMZ 75～100 mg·kg-1·d-1，分3次静脉输入；8例联合卡泊芬净治疗。4例合并CMV感染者予更昔洛韦治疗，3例合并细菌感染者予相应抗生素治疗。8例患儿无创通气效果欠佳，改用有创呼吸机辅助通气；2例经无创双水平正压通气后呼吸困难好转；2例经鼻持续气道正压通气、1例经常规吸氧治疗后，低氧血症改善。同时针对原发病进行治疗。3例发生气胸，其中1例(例2)给予胸腔闭式引流。

13例中6例死亡，7例存活。存活患儿住PICU时间23～65 d。

2.3 影像学表现 胸部X线片(图1)显示，13例均表现为双肺透亮度下降并呈磨玻璃样变，2例有纵隔积气和皮下气肿。胸部CT(图2)显示，13例双肺均呈磨玻璃样改变， 3例气胸，2例有皮下气肿和纵隔气肿，1例肺气囊改变，1例少许胸腔积液。存活的7例患儿90 d后复查胸部CT肺部渗出影基本吸收。

表1 13例非HIV感染PJP患儿的临床特征

图1 PJP患儿胸部X线片

图2 PJP患儿胸部CT

2.4 存活患儿和死亡患儿的比较 表2显示，性别构成比、年龄、感染、免疫抑制剂应用、气胸、血WBC计数、LDH、BDG、CRP、CD4+细胞比例在2组间差异无统计学意义。死亡患儿淋巴细胞计数(P=0.012)和氧合指数(PaO2/FIO2，P=0.027)低于存活患儿，发病至开始SMZ治疗的时间长于存活患儿(P<0.038)。

3 讨论

PJ通过空气飞沫传播，常寄生在肺泡内， 以包囊和滋养体的形式存在。正常人群通过细胞免疫清除PJ，当宿主免疫功能低下，处于潜伏期的PJ大量繁殖。非HIV免疫抑制患者的PJP较HIV患者的PJP起病急、病程进展快，在成人中病死率为26%～64%[4-6]。PJP的预后在儿童中报道少见，一项乌干达儿童PJP预后的研究显示，儿童病死率为40%[7]。本文13例非HIV感染的PJP患儿病死率为46.2%。Bienvenu等[6]研究中461例HIV阴性PJP患者基础病以血液系统恶性肿瘤(39.3%)最常见，其次为癌症(26.9%)、自身免疫性疾病(11.3%)、实体器官移植(7.4%)。本文患儿以肾病综合征最多见，其次为先天性免疫缺陷病和血液系统肿瘤，与儿童和成人疾病谱系不同有关，儿童恶性肿瘤发病率较成人低，且多数先天性免疫缺陷病患儿不能存活到成年，近年来对血液肿瘤患儿常规预防性应用TMP-SMZ，使PJP在血液系统恶性肿瘤中的发病率明显下降。有研究显示，儿童肾病综合征预防性应用TMP-SMZ，可降低PJP的发病率[8]，但目前仅局限于单中心、小样本的研究。

表2 存活患儿和死亡患儿的临床资料比较 [n(%)]

HIV阴性PJP患者的临床表现主要为胸闷、干咳、发热，随着病程迅速进展，逐渐出现气促和进行性加重的呼吸困难，伴严重的氧合障碍、弥漫性肺泡损伤。体征和肺部严重程度不一致是该病的典型临床表现。本文13例HIV阴性PJP患儿的主要临床表现为发热、气促和咳嗽，小婴儿可表现为呻吟，肺部听诊11例无啰音，呈现症状与体征分离的表现。土耳其的一项研究[9]显示，PJP合并急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是影响预后的独立危险因素，本文中死亡患儿PaO2/FIO2较存活患儿低，与该文献结果一致。

血清学检查简便且创伤小，研究者一直试图通过血液学检查实现PJP的诊断。BDG为PJ细胞壁的组成成分之一，能刺激机体产生相应的免疫反应。一项Meta分析[10]结果显示，血清BDG在HIV阳性和HIV阴性的PJP患者中的敏感度分别为92%和85%，并提出通过检测BDG可基本排除HIV阳性病例中的PJ感染，但对于HIV阴性者有假阴性的可能，需结合临床症状和影像学结果进行分析。有研究报道LDH升高诊断PJP的敏感度可达100%，但其特异度仅为47%[11]。邓春涛等[12]认为，LDH对诊断PJP有一定价值，尤其是AIDS患者。另有研究指出，将BDG和LDH联合用于PJP诊断时，诊断界值BDG为400 pg·mL-1、LDH为350 U·L-1时，特异度达83.9%[13]。本文13例患儿中，LDH均升高，8例BDG升高，但存活患儿和死亡患儿间LDH和BDG差异均无统计学意义，提示LDH和BDG可能与预后无关。

PJ除可造成肺机械性损伤外，炎症反应导致Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞膜受损，从而引起肺泡和肺间质改变[6,14]，这是PJP发病的病理生理学基础。影像学检查对于PJP的诊断极其重要，早期胸部X线检查无明显改变，随着病程进展，出现双侧、弥漫性、对称性小颗粒状或网状渗出影的典型表现，病灶主要分布于肺门周和下肺野[15]。PJP患者CT通常表现为铺路石征、磨玻璃征、肺气囊征、月牙征、支气管血管束长索条征以及混合型，以磨玻璃征最常见[16]。本文13例病例均出现磨玻璃样改变，3例有气胸、纵隔积气。

有文献[17]报道，非AIDS的PJP患者，如影像学表现有气胸、纵隔气肿和皮下气肿，提示预后不良。本文中死亡患儿淋巴细胞计数和PaO2/FIO2低于存活患儿，发病至开始SMZ治疗的时间长于存活患儿，与成人报道[18-20]一致，但是否发生气胸、是否合并其他感染在本文死亡和存活患儿间差异无统计学意义。

综上所述，当免疫功能低下的患儿出现不明原因的发热、气促、干咳、进行性加重的呼吸困难，肺部CT检查提示双肺磨玻璃样变，需考虑PJP可能，一旦磨玻璃区内出现肺气囊或气胸应高度怀疑，及早进行病原学检查。当高危患儿出现可疑症状时，应立即经验性给予TMP-SMZ治疗，不必等待病原学结果，以免延误病情。