新型络合试剂-紫外分光光度法测定石膏中钙含量△

李晓明，魏旭雅，赖长江生

中国中医科学院 中药资源中心 道地药材国家重点实验室，北京 100700

石膏为一种常用的矿物类中药[1]，主要成分为含水硫酸钙(CaSO4·2H2O)，并混有其他形式的钙元素[2]及众多其他金属元素[3]，具有清热泻火、除烦止渴的功效；用于外感热病、高热烦渴、肺热喘咳、胃火亢盛、头痛、牙痛等治疗。

目前，按照石膏含量测定原理分类，可分为2种方法：一种是基于钙元素含量折算石膏含量[4-5]，另一种是基于硫元素含量折算石膏含量[6]。其中，已被广泛采纳的方法是《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)推荐的基于钙元素含量测定的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)配位(络合)滴定法[7-8]，该方法操作简便、精密度高。但是，该方法样品消耗量较大，测定时pH需严格控制在12～13，否则影响指示剂钙黄绿素终点显色的灵敏度[9]；此外，该方法时常出现不溶物质，滴定终点颜色难以判定，造成滴定终点提前[10]。所以，该方法人为判定误差较大，耐受性相对较差。此外，国内外学者还建立了许多新方法用于石膏中钙含量的测定[11-12]，但都较难满足一线药物含量测定的需求。

为了对石膏的含量测定提供一种方法补充，用于解决滴定终点难以判定的难题，本课题组进行了基于乙二醛双缩 (2-羟基苯胺) (GBHA)[13]的比色法测定石膏中钙含量的研究。GBHA及其衍生试剂已用于水质、食品、临床等领域钙离子浓度的测定[14-15]。在本研究中，新建方法用于测定12个省份18批石膏样品的含量，结果证实该方法简便、重复性好，测定结果准确，可作为石膏质量控制标准的替代方法。

1 材料

1.1 仪器

水为自制的纯水(50G型帕斯蒂卡超纯水机，北京子涵世纪科技有限公司)；T6型新世纪紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；BP-211D型十万分之一电子天平、BS-210S型万分之一电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；ES30A温控电热/磁力搅拌器(北京伯泰科仪器有限公司)。

1.2 试药

络合试剂-紫外可见分光光度法所用试剂 GBHA溶液：称取GBHA(国药集团化学试剂有限公司，批号：20080916，纯度≥97.0%，分析纯)50.0 mg，置100 mL乙醇中，超声溶解，摇匀后，贮藏于冷藏箱中，限用10 d。钙溶液：精密量取钙标准液(国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院，批号：10033032，质量浓度为1000 μg·mL-1，介质为5%盐酸，国家标准溶液)0.5 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释，制成5 μg·mL-1的钙溶液。稀盐酸溶液1：取浓盐酸(北京化工厂，批号：20090726，体积分数为36.0%～38.0%，分析纯AR)58.5 mL，加水稀释至250 mL。0.6 mol·L-1氢氧化钠溶液：取氢氧化钠(生工生物工程上海有限公司，批号：0173，纯度>98.5%)6 g，溶于250 mL纯水中。无水乙醇(北京化工厂，批号：20090910，分析纯)。

EDTA-2Na配位(络合)滴定法所用试剂钙黄绿素指示剂：取钙黄绿素(批号：20090806)0.1 g，加氯化钾10 g，研磨均匀。甲基红指示剂溶液：取甲基红(国药集团化学试剂有限公司，批号：20091209)0.05 g，加3.7 mL的0.05 mol·L-1氢氧化钠溶液使其溶解，加水稀释至100 mL。氢氧化钾溶液：取氢氧化钾(北京试剂厂，批号：20060329，分析纯)32.5 g，加水使其溶解至250 mL。稀盐酸溶液2：取上述浓盐酸58.5 mL，加蒸馏水稀释至250 mL。EDTA-2Na标准试剂，浓度为0.05 mol·L-1(国家化学试剂质检中心，批号：201001)。

对照品CaSO4·2H2O(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20090612，分析纯，纯度≥99.0%)。

样品：石膏样品1～18，包括生石膏块、生石膏片、生石膏粉和煅石膏块4种规格，产地包括四川、山东、湖南、河北、广西、甘肃、河南、北京、内蒙古、安徽、湖北和陕西，具体样品信息见表1。

表1 石膏样品收集产地与规格

2 方法与结果

2.1 方法

络合试剂-紫外可见分光光度法：取钙溶液(5.0 μg·mL-1)2.00 mL，加GBHA溶液0.6 mL，无水乙醇4.4 mL，用0.6 mol·L-1氢氧化钠溶液调pH=12.0(约0.40 mL)，用水定容至10 mL，摇匀，用1 cm比色皿，放置10 min左右，以试剂溶液为空白，测定吸光度。其中石膏样品溶液的制备方法为取石膏样品约2 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加稀盐酸1.0 mL加热溶解，0.6 mol·L-1氢氧化钠溶液调至中性(约4.0 mL)，加水至刻度，摇匀。取2.00 mL该试液，按照试验方法测吸光度，由标准曲线计算钙含量。钙的百分含量乘以系数4.296，即为石膏含量(以CaSO4·2H2O计)。

EDTA-2Na配位(络合)滴定法[1]：取供试品的细粉(100目)约0.2 g，精密称定，置锥形瓶中，加稀盐酸10 mL，加热使溶解，加水100 mL与甲基红指示液1滴，滴加氢氧化钾试液至溶液显浅黄色，再继续多加5 mL，加钙黄绿素指示剂少量，用EDTA-2Na滴定液(0.05 mol·L-1)滴定，至溶液的黄绿色荧光消失，并显橙色。每毫升乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05 mol·L-1)相当于8.608 mg的CaSO4·2H2O，或相当于6.807 mg的CaSO4，进而折算成石膏含量。此方法作为参照方法。

2.2 结果

2.2.1样品描述 样品1～7号呈纤维性块状，8～15为纤维性片状，16～18为粉状。除4、8、10号样品呈现红色外，其他样品均为白色(样品9、12、13、15～17)、白灰色(样品2、6、7)或淡黄色(样品1、5、11、14、18)，或半透明(样品3)。故除样品4、8、10外，其余样品均符合《中国药典》的性状描述，见图1。

2.2.2络合试剂-紫外可见分光光度法 吸收波长的选择：按照2.1方法，以试剂溶液作空白，在300～700 nm波长，对GBHA 溶液和钙络合物进行扫描，最大吸收在526 nm处(见图2)，所以选择526 nm作为工作波长。

图2 GBHA钙络合物紫外-可见光扫描曲线

稳定性试验：按照试验方法，在各个时间点测定样品溶液的吸光度值，发现样品在10～20 min内达到最大吸收值，显色稳定，RSD为0.14%，说明本实验中的样品稳定量良好，适合于室温检测，可满足在室温下定量的要求。

标准曲线的绘制：在6个10 mL量瓶中，分别加入5.00 μg·mL-1Ca2+标准溶液0、0.60、1.20、1.80、2.00、2.40、3.00 mL，按照试验方法测吸光度，以Ca2+溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，线性回归方程：Y=0.043 3X+1.785×10-3，r=0.999 2。新建立的络合试剂-紫外可见分光光度法的测定的质量浓度为0～15.0 μg·mL-1。

精密度试验：按照试验方法，测定样品溶液的吸光度值6次，RSD为0.13%，表明该方法经多次取样测定精密度良好。

重复性试验：平行取6份石膏样品，每份约2 mg，精密称定，按照试验方法测吸光度，计算RSD。数据显示，重复性试验的RSD为2.66%，满足实验要求。

加样回收率试验：取生石膏约1 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，另加入钙溶液 1.00 mL，加稀盐酸1.0 mL加热溶解，0.6 mol·L-1氢氧化钠溶液调至中性(约4.0 mL)，加水至刻度，摇匀。在6个10 mL 量瓶中，分别加入已知含量的样品溶液2.00 mL，按照试验方法[16]，测定吸光度值，求得加样回收率，平均加样回收率为101%，RSD为0.1% (见表2)。

注：样品1 ～ 6为石膏块；7 ～ 15为石膏片；16 ～ 18为石膏粉，其中6号样品为煅石膏块。图1 石膏样品

表2 石膏加样回收率试验结果(n=6)

2.2.3样品溶液的测定 取生石膏约2 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加稀盐酸1.0 mL加热溶解，0.6 mol·L-1氢氧化钠溶液调至中性(约4.0 mL)，加水至刻度值，摇匀。取2.00 mL该试液，按照试验方法测吸光度值，由标准曲线计算钙含量，结果见表3。

表3 比色法石膏含量测定结果

实验结果可知，从安徽、广西龙瑞、广西玉林、河南、陕西山阳县、陕西商洛、内蒙古多伦所购的石膏样品，含量偏低，不符合《中国药典》规定。所有其他样品(包括煅制样品)均符合《中国药典》石膏项下含量不得少于95%。此外，样品2、6、16中的其他物质可能影响了新型络合试剂-紫外可见分光光度法测定CaSO4·2H2O含量，导致测定值超过100%。

3 讨论

EDTA配位(络合)滴定法的原理是CaSO4·2H2O先被稀盐酸分解成易解离的CaCl2和Ca(HSO4)2，在pH>12时溶液中Ca2+与钙黄绿素指示剂形成络合物而显黄绿色荧光，终点到达时微过量的EDTA置换出指示剂络合物中的Ca2+，黄绿色荧光消失[11]。且加热80 ℃以上方可完全解离。石膏中其他金属含量占比可达到0.045 3% ～ 0.234 3%[17]，但不影响EDTA配位(络合)滴定法测定CaSO4·2H2O的含量。

程英明等[17]报道络合剂GBHA 溶液量在0.55～0.65 mL吸光度值最大，且最大吸收峰为516 nm，本实验选0.60 mL，即GBHA与Ca的物质的量比为5∶1，生成的络合物稳定，经扫描，最大吸收在526 nm处，故选526 nm为工作波长。在实验操作时发现，应严格控制乙醇的加入量，否则会导致测定结果偏小。由线性回归方程Y=0.043 3X+1.785×10-3(r=0.999 2)，可知检测质量浓度为0～15.0 μg·mL-1与吸光度线性关系良好，平均加样回收率为101% (RSD 为0.10%，n=6)。新型络合-紫外可见分光光度法操作简便、重复性好，测定结果准确。

致谢：山西长治医学院药学06级毕业生张明秀参与测试。