毛排钱草的体外抑菌活性及稳定性评价△

罗晓东，吴志明，李海秀，吴欢，张声源，廖富林，肖光文*

1.嘉应学院 广东省山区特色农业资源保护与精准利用重点实验室，广东 梅州 514015；2.嘉应学院 医学院，广东 梅州 514031

毛排钱草Phyllodiumelegans(Lour.) Desv.别名钱串草、叠钱草、鳞狸鳞、连里尾树等，为豆科排钱树属PhyllodiumDesv.植物，分布在福建、广东、海南、广西及云南等省区，是我国瑶族常用的民族药。其主跌打瘀肿、风湿痹痛、慢性肝炎，具有消炎解毒、活血利尿、清热下痢等功效，常用于治疗风湿痹痛、慢性肝炎、小儿疳积、乳痈、瘰疬等症[1]。

目前，针对毛排钱草的药理活性研究主要侧重于其对肝炎的治疗，而抗炎、抑菌等药理活性研究较少。文献资料显示，排钱树属植物化学成分以生物碱类为主，还含有醇类、萜类、酚类、黄酮类、糖类和芳香类等化合物[2]，具有抗炎、抑菌、抗肝炎、抗肿瘤等活性[3-4]。课题组在前期的实验中发现毛排钱草对金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌活性，但其药用活性部位不明确，活性物质基础不清晰。因此，本研究以毛排钱草为研究对象，考察其根、茎和叶3个不同药用部位醇提物的抑菌活性，以筛选活性药用部位，明确活性物质基础，进而探讨其在不同环境条件下的抑菌稳定性，为毛排钱草的药用价值的开发及天然食品防腐剂的研究提供理论依据。

1 材料

1.1 试药

毛排钱草于2018年9月购自广西省玉林市博白县，经嘉应学院医学院天然药物教研室翟明讲师鉴定为豆科排钱树属植物毛排钱草P.elegans(Lour.) Desv.。留样保存于客家养生保健研究所客家中草药化学实验室。实验所用菌种包括金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC6538、藤黄微球菌MicrococcusluteusATCC49732、大肠埃希菌EscherichiacoliATCC25922、铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosaATCC9027、枯草芽孢杆菌BacillussubtilisATCC6633、变形杆菌ProteusvuigarisATCC13315，均来源于广东省菌种保藏中心，保存于嘉应学院医学院病原教研室。

青霉素钠原料药(批号：6121010150，纯度≥99%)、硫酸链霉素原料药(批号：73210101100，美国药典级)，美国Genview公司；95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮等均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；水为灭菌蒸馏水；MH琼脂培养基(批号：190306)、营养肉汤培养基(批号：190308)均购自江门凯林贸易生物公司。氯化钠、氯化钾、无水氯化钙、三氯化铁、氢氧化钠(国药集团化学试剂有限公司)；无水柠檬酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 仪器

FL-30型流水式高速中药粉碎机(瑞安市富力中药机械厂)；N-1100V型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；TG16-WS型台式高速离心机(长沙维尔康湘鹰离心机有限公司)；YXQ-LS-75SII型立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)；BSC-1100ⅡA2-X型超净工作台(济南鑫贝西生物技术有限公司)；PB-21型酸度计[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；WFH-203B型三用紫外分析仪(上号精科实业有限公司)；WGZ-XT型细菌浊度仪(杭州齐威仪器有限公司)。

2 方法

2.1 毛排钱草不同药用部位的体外抑菌活性测定

2.1.1不同药用部位醇提物的制备 称取毛排钱草根、茎、叶干品100 g，粉碎，分别加入95%乙醇浸泡过夜，室温下超声(功率：250 W，频率：45 kHz)提取3次，每次30 min，真空抽滤，合并3次滤液，减压旋转蒸发浓缩，分别得毛排钱草根、茎、叶醇提物浸膏10.22、7.10、10.50 g。将各提取物用40%丙酮-蒸馏水溶液溶解，制备成生药质量浓度为1 g·mL-1的药液(相当于根、茎、叶药液每毫升分别含有0.102 2、0.071 0、0.105 0 g醇提物浸膏)，密封置4 ℃冰箱保存，备用，实验前均用0.22 μm微孔滤膜除菌。

2.1.2对照液的制备 空白对照液：40%丙酮-蒸馏水溶液。阳性药对照液：将40%丙酮-蒸馏水溶液作为溶剂，分别配制质量浓度为青霉素钠128 μg·mL-1和硫酸链霉素300 μg·mL-1的药液。

2.1.3菌悬液的制备 超净工作台内，从斜面培养基上挑取适量菌落接种于肉汤培养基中，于37 ℃培养18～24 h，转接1次。使用前用生理盐水稀释各实验菌株至0.5麦氏浊度(相当于1.5×108CFU·mL-1)，再取适量菌悬液，用生理盐水或肉汤培养基稀释至1.5×106CFU·mL-1，备用。

2.1.5最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定 采用微量肉汤稀释法测定MIC。超净工作台内，取一次性无菌96孔培养板，第2孔至第11孔均加入100 μL肉汤培养基，再分别吸2.1.1项制备的药液100 μL注入第1、2孔，反复吹打，充分混匀后从第2孔中吸100 μL注到第3孔，如此等倍稀释，至第10孔吹打混匀后弃去100 μL；第11孔不加入药液，以观察菌是否适宜生长；第12孔注入200 μL肉汤培养基，以此判断培养基是否被污染。随后分别向上述1～11孔中注入含1.5×106CFU·mL-1各实验菌的肉汤培养基100 μL，充分混匀后放入37℃恒温培养箱中培养18～24 h，取出观察生长情况，以培养基澄清透明或无沉淀为无菌生长，将无菌生长实验孔中最低生药浓度记作MIC。

分别从无菌生长实验孔中吸取培养基100 μL分别注到MH琼脂培养基表面，涂布均匀后放入37 ℃恒温培养箱中继续培养18～24 h，取出观察结果，用活菌计数法计数菌落，将平均菌落数<5的最小生药浓度记作MBC。以上实验平行操作3次。

2.2 毛排钱草根不同极性提取物的体外抑菌活性测定

2.2.1不同极性部位提取物的制备 称取1 kg毛排钱草根经粉碎后，按照2.1.1项下方法制得毛排钱草根的醇提物浸膏102.26 g。取90 g浸膏超声分散于蒸馏水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3～5次，合并萃取液，减压旋转浓缩，分别得石油醚部位1.10 g、乙酸乙酯部位5.07 g、正丁醇部位18.64 g、水部位61.14 g，样品均置于干燥西林瓶中密封保存备用。将各样品用40%丙酮-蒸馏水溶液溶解，制备成生药质量浓度为1 g·mL-1的药液(各层药液每毫升分别含有0.001 2、0.005 7、0.021 1、0.069 3 g浸膏)，密封置4 ℃冰箱保存，备用，实验前均用0.22 μm微孔滤膜除菌。

2.2.2抑菌活性评价 依次吸取2.2.1项制备的药液，按照2.1.4项下方法评价各极性部位药液对 6种菌的抑菌活性。依次吸取2.2.1项制备的药液，按照2.1.5项下方法分别测定各极性部位药液对6种菌的MIC和MBC。

2.3 毛排钱草根正丁醇部位抑菌稳定性研究

2.3.1热稳定性研究 参考陈佳佳等[6]实验方法，将生药质量浓度为1 g·mL-1的毛排钱草根正丁醇部位药液于60、80、100、121 ℃条件下(其中60、80、100 ℃于水浴锅中水浴30 min，121 ℃于高压蒸汽锅中湿热处理30 min)处理后，以金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌作为指示菌，采用牛津杯法测定其抑菌活性，并以未经处理过的药液(40 ℃)作为对照。

2.3.2紫外线稳定性研究 参考李晨等[7]实验方法略作修改，将生药质量浓度为1 g·mL-1的毛排钱草根正丁醇部位药液置于紫外灯(254 nm)下照射10、20、30、60 min后，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别作为指示菌，以未经处理过的药液(0 min)作为对照。

2.3.3酸碱稳定性研究 参考任先伟等[8]实验方法略作修改，用0.1 mol·L-1NaOH和0.1 mol·L-1柠檬酸调节毛排钱草根正丁醇部位药液的pH，分别调整pH为3、5、7、9、11，同时药液的生药质量浓度为1 g·mL-1，平衡30 min，以金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别作为指示菌，并以未经处理过的药液(pH=5.9)作为对照。

2.3.4金属离子稳定性研究 参考张媛媛[9]实验方法，在毛排钱草根的正丁醇提取物中分别加入NaCl、KCl、CaCl2和FeCl3，分别配制成含0.05 mol·L-1的Na+、K+、Ca2+和Fe3+溶液，同时药液的生药质量浓度为1 g·mL-1，静置3 h，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别作为指示菌，以未经处理过的药液作为对照。

3 结果与分析

3.1 毛排钱草不同药用部位提取物体外抑菌活性

实验结果表明，毛排钱草根、茎和叶对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌等6种菌均具有不同程度的抑菌作用，其作用强弱为根>叶>茎(见表1)。毛排钱草不同药用部位对6种菌的MIC、MBC结果与抑菌圈测定结果吻合(见表2)。其中毛排钱草根的抑菌活性较强，对6种菌均有抑菌作用(MIC、MBC在7.81～500.00 mg·mL-1)；其次是毛排钱草叶、茎，但对大肠埃希菌无明显抑菌活性。因此，下一步将对毛排钱草根不同极性部位进行抑菌活性评价，以明确其强活性部位。

表1 毛排钱草不同药用部位的抑菌圈直径 mm

表2 毛排钱草不同药用部位提取物对各菌株的MIC和MBC mg·mL-1

3.2 毛排钱草根不同极性部位提取物体外抑菌活性

由表3、4可见，在相同生药质量浓度下，毛排钱草根不同极性部位对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰阳性菌均表现出不同程度的抑菌活性，对大肠埃希菌、变形杆菌等革兰阴性菌活性较差；总体抑菌活性表现为正丁醇部位>水部位>乙酸乙酯部位>石油醚部位，其中正丁醇部位对各种菌的MIC、MBC在15.63～125.00 mg·mL-1，对铜绿假单胞菌亦表现出一定的抑菌效果。因此，后续实验以正丁醇部位作为研究对象，考察其在不同条件下对敏感菌的抑菌稳定性。

表3 毛排钱草根不同极性部位的抑菌圈直径 mm

表4 毛排钱草根不同极性部位提取物对各菌株的MIC和MBC mg·mL-1

3.3 毛排钱草根正丁醇部位的抑菌稳定性

3.3.1温度对提取物抑菌稳定性的影响 与40 ℃时比较，温度为60 ℃时，毛排钱草根正丁醇部位对金黄色葡萄球菌的抑菌活性明显减弱(P<0.05)，但仍然保持敏感；随着温度的升高，抑菌活性持续减弱。对于铜绿假单胞菌，温度为60～121 ℃时抑菌活性明显减弱(P<0.001)，但随温度升高变化不明显，见图1。

注：与40 ℃比较，*P<0.05，***P<0.001。图1 温度对毛排钱草根正丁醇部位抑菌活性的影响

3.3.2紫外线对提取物抑菌稳定性的影响 由图2可知，随着紫外线照射时间的延长，毛排钱草根正丁醇部位对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径大小作用不明显；经紫外线照射10 min后其对金黄色葡萄球菌的抑菌活性降低，且随着照射时间的推移，抑菌活性呈持续降低的趋势(P<0.05，P<0.001)。

注：与0 min比较，*P<0.05，***P<0.001。图2 紫外线对毛排钱草根正丁醇部位抑菌效果的影响

3.3.3pH对提取物抑菌稳定性的影响 由图3可知，与pH=5.9比较，在pH=9时，毛排钱草根正丁醇部位对敏感菌的抑菌活性较强(P<0.001)；随着pH的降低，抑菌活性逐渐减弱。当pH=11时，抑菌活性较pH=9时弱，但强于pH≤7。

注：与pH=5.9比较，*P<0.05，***P<0.001。图3 pH对毛排钱草根正丁醇部位抑菌效果的影响

3.3.4金属离子对提取物的抑菌稳定性影响 由图4可知，对于金黄色葡萄球菌，在一定离子浓度下，金属离子对毛排钱草根提取物抑菌效果的抑制作用强弱为Fe3+>Ca2+>Na+>K+(P<0.001)；而对于铜绿假单胞菌，Na+、K+和Ca2+抑制作用强且相似(P<0.001)。

注：与对照组比较，***P<0.001。图4 金属离子对毛排钱草根正丁醇部位抑菌效果的影响

4 讨论

根据体外抑菌活性的测定结果，毛排钱草根、茎、叶均存在不同程度的抑菌活性，其中根的抑菌作用优于茎、叶。毛排钱草根不同极性部位对各菌株的MIC、MBC定量测定结果与抑菌圈直径定性测定结果吻合，抑菌活性强弱依次为正丁醇部位>水部位>乙酸乙酯部位>石油醚部位，说明抑菌活性成分可能集中在毛排钱草根的正丁醇部位。此外，在对毛排钱草的化学成分研究中发现，其地上部分含有羽扇豆烯酮、羽扇豆醇、白桦醋醇、白桦酸、异香兰酸、柠檬酚、异柠檬酚、白桦醋酸、原儿茶酸、香橙素、木犀草素等化合物[2，10-12]；而文献资料亦显示，白桦醋醇、原儿茶酸、木犀草素等均具不同程度的体外抑菌活性[13-15]，由此推测，毛排钱草根可能含有上述黄酮类、萜类或生物碱类等成分。在此基础上，可进一步对毛排钱草根进行化学成分分析，探究其具有抑菌或杀菌活性的单体化合物。

在稳定性评价结果中，经过不同温度加热处理后，提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果无明显变化，对铜绿假单胞菌的抑菌活性则明显减弱，但仍保持一定的敏感性，可能是因为提取物中可抑制革兰阴性菌的有效成分中部分不耐高温，经60～80 ℃高温处理后失去了活性，这与吴少辉等[16]研究结果基本一致，说明提取物具有较好的热稳定性。而随着紫外线照射时间的变化，提取物对铜绿假单胞菌的抑菌效果变化不明显，但对于金黄色葡萄球菌的抑菌活性有所下降，说明提取物应尽量避光保存。

在不同pH作用下，提取物抑菌活性均出现不同程度的抑制。在实验设置的pH条件下，随着pH的增加，提取物对敏感菌的抑菌圈直径均高于对照组，但当pH为11时抑菌效果出现减弱，说明在中性或偏碱性条件下，可能对提取物有效成分起到了协同作用，从而抑菌活性得到了增强；当环境pH低于5.9，提取物对敏感菌的抑菌活性有所下降，说明偏酸性条件下可能破坏了提取物的抑菌活性成分，对抑菌效果产生了抑制。

在Fe3+、Ca2+、Na+、K+等离子作用下，提取物的抑菌活性均受到不同程度的抑制，其中Fe3+对金黄色葡萄球菌抑制作用较为明显；在实验过程中，加入Fe3+后药液由酒红色变为墨绿色并且有少量沉淀产生，该沉淀物可能为主要活性成分与Fe3+离子络合形成的。其他金属离子的加入并未使药液发生明显变化而抑菌效果有所下降，可能是金属离子的存在改变了细胞内外离子浓度及渗透压，影响了提取物的作用靶点，从而产生不同的抑制作用，确切原因有待进一步研究。