MIF 在诱导类风湿关节炎滑膜增殖中的作用及机制研究*>

余淑娇 吴锐

（南昌大学第一附属医院风湿免疫科 江西南昌330006）

类风湿关节炎（RA）是一种病因未明的慢性疾病，临床上以延续滑膜炎为主，其特征为手、足小关节的多关节、对称性及侵袭性关节炎症，随着病情的不断发展引起关节畸形、功能丧失，影响患者健康、生活[1]。RA 病因复杂，普遍认为与遗传、感染及性激素等有关，且患者发病后常伴有细胞增生、间质大量炎性细胞浸润及微血管新生、骨组织破坏等，具有类似于“局部恶性肿瘤”的增生性与破坏性特点[2]。既往研究表明：巨噬细胞移动抑制因子（MIF）在RA患者滑膜炎症中发挥了重要作用，属于一种内分泌免疫物质，能限制体内巨噬细胞活动[3]。本研究以关节置换术的RA 患者作为对象，探讨MIF 在诱导类风湿关节炎滑膜增殖中的作用及机制。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2018年3月～2019年6月行关节置换术的RA 患者46例作为对象。其中男25例，女21例；年龄44～65 岁，平均（57.56±5.66）岁；病程11～25年，平均（19.43±4.31）年。

1.2 仪器与设备 见表1。

表1 仪器与设备

1.3 纳入与排除标准 纳入标准：（1）符合RA 诊断标准，均经临床确诊[4]；（2）均拟行关节置换术治疗，且可耐受手术；（3）能与家属和（或）医师进行交流。排除标准：（1）合并恶性肿瘤、器质性疾病或血液系统疾病者；（2）合并精神异常、认知功能障碍或肝肾异常者。

1.4 检测方法

1.4.1 MIF 表达水平测定 （1）RNA 的分离、提取。手术过程中取RA 患者滑膜组织及正常组织（距病灶超过2 cm 的组织），向标本中加入Trizol 500 μl，充分混合后转移到1.0 ml 离心管，振荡5 min 后静置。向不同组织中加入氯仿200 μl 振荡15 s，静置5 min 后离心15 min，离心力12166×g。去除上层清液，加入预冷的乙醇（浓度75.0%）1 ml，常温下干燥7 min，经紫外分光度仪A260 下测定吸光度值。（2）检测方法。采用实时荧光PCR 技术测定不同组织中MIF 表达水平，引物见表2[5]。PCR 参数：30℃下10 min；42℃下30 min；99℃下5 min；5℃下5 min，连续进行35 个循环，72℃下10 min 延长，获得最终产物并放入1.5%琼脂凝胶电泳，β-actin 为内对照。

表2 MIF 引物设计

1.4.2 siMIF 转染滑膜细胞 取滑膜细胞原代培养，并连续完成72 h 转染siMIF，利用转染试剂盒（R0510）操作说明书完成细胞的转染。应用1×riboFECTTM CP Buffer 稀释siRNA，充分混合后加入3 μl riboFECTTM CP Reagent，完成转染复合物的制备。常温下完成10 min 孵育，将转染复合物加入适量的无双抗完全培养基中，充分混合均匀后放置在37℃孵育箱中连续进行24～72 h 培养[6]。

1.4.3 细胞活性及细胞凋亡测定 （1）细胞活性测定。采用CCK8 法完成细胞活性测定，取未转染、转染后对细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，接种在96孔板输尿管，每孔100 μl，连续进行24～72 h 培养，然后向每孔中加入CCK810 μl，孵育箱中连续进行2 h 培养，450 nm 酶标仪下完成吸光度值测定[7]。（2）细胞凋亡测定。采用流式细胞仪完成不同细胞凋亡测定。取转染后及未转染的细胞，将培养液吸出到15 ml 离心管中，采用PBS 完成1 次冲洗，加用浓度为0.25%胰酶进行消化2 min，然后向细胞中加入终止培养液终止培养。轻轻吹下细胞，并将其转移到15 ml 离心管中进行离心5 min，速度1000 rpm，去除上层清液后加入PBS，调整细胞数为1×106/ml，取细胞悬液1 ml，离心5 min，离心速度1000 rpm，去除上清并向细胞中加入Annexin V-TDTC 5 μl，并加入PI 10 μl，充分混合后避光孵育10 min。上述操作完毕后采用流式细胞仪进行检测[8]。

1.5 观察指标 （1）RA 患者正常组织与滑膜组织中MIF RNA 表达水平；（2）转染MIF 与未转染MIF细胞活性、凋亡率。

1.6 统计学分析 采用SPSS18.0 统计学软件处理数据。计数资料用%表示，行χ2检验；计量资料用（±s）表示，行t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中MIF RNA 表达水平比较 RA 滑膜组织中MIF RNA 表达水平高于正常组织（P＜0.05）。见图1。

图1 不同组织中MIF RNA 表达水平比较

2.2 不同细胞活性比较 转染MIF 与未转染MIF细胞均完成72 h 培养，随着培养时间的延长细胞增殖速度增加，转染MIF 细胞24 h、48 h 及72 h 细胞增殖率均高于未转染MIF 细胞（P＜0.05）。见图2。

图2 不同细胞活性比较

2.3 不同细胞凋亡率比较 转染MIF 与未转染MIF 细胞培养24 h、36 h 细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；转染MIF 细胞培养48 h、72 h细胞凋亡率均低于未转染MIF 细胞（P＜0.05）。见表3。

表3 不同细胞凋亡率比较（%，±s）

表3 不同细胞凋亡率比较（%，±s）

细胞类型 24 h 36 h 48 h 72 h转染MIF非转染MIF tP 36.39±4.5335.88±4.521.2130.63743.73±5.0942.49±5.030.8910.66258.78±6.7375.93±7.817.4510.00065.02±7.8280.48±7.895.3980.000

3 讨论

RA 是临床常见疾病，病理改变以滑膜炎、滑膜组织增生为主。滑膜细胞包括滑膜成纤维细胞、滑膜巨噬细胞，而滑膜成纤维细胞在滑膜细胞增殖、迁移及促炎中发挥了重要的作用。MIF 在人体中较为重要，是一种内分泌免疫物质，能限制体内巨噬细胞的活动。临床研究[9]表明，当身体某个器官发生不正常的细胞活动后，会将信号反馈到内分泌-免疫网络，从而产生移动因子，并作用在巨噬细胞上，能促进巨噬细胞快速移动到不正常细胞的活动区域进行吞噬。当该吞噬行为达到一定程度后，内分泌-免疫网络将会接受到反馈信号，限制巨噬细胞过量吞噬。

本研究中，RA 滑膜组织中MIF RNA 表达水平高于正常组织（P＜0.05）；转染MIF 与未转染MIF细胞均完成72 h 培养，随着培养时间的延长细胞增殖速度增加，转染MIF 细胞24 h、48 h 及72 h 增殖率均高于未转染MIF 细胞（P＜0.05），说明MIF 在RA 患者中呈高表达，能促进细胞的增殖。为了进一步分析MIF 在类风湿关节炎细胞中的作用，本研究中将MIF 转染到类风湿关节炎细胞中，完成细胞凋亡测定，结果转染MIF 与未转染MIF 细胞培养24 h、36 h 细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；转染MIF 细胞培养48 h、72 h 细胞凋亡率均低于未转染MIF 细胞（P＜0.05），说明MIF 能抑制类风湿关节炎滑膜细胞凋亡。因此，临床上积极采取有效的措施抑制MIF 能延缓病情进展，有望实现对RA 的有效治疗[10]。综上所述，MIF 在类风湿关节炎组织中呈高表达，能促进类风湿关节炎滑膜细胞的增殖，抑制其凋亡，从而参与滑膜增生。