超高效液相色谱-串联质谱测定牛奶中喹赛多残留

2020-12-16马晓年张秀清陈俊秀欧利华

湖北农业科学 2020年21期

马晓年，张秀清，陈俊秀，欧利华

（昆明市疾病预防控制中心，昆明 650228）

喹赛多（Cyadox，CYX）是华中农业大学兽药研究所合成的一种新型抗病［1］、促生长化合物，化学名为2-喹噁啉亚甲肼基氰基乙酸-1，4-二氧化物，属于喹噁啉-N-1，4-二氧化物的衍生物。喹赛多是喹噁啉的一个新品种，不论是对动物的一般毒性，还是特殊毒性，均比其同类药物要好［1-3］，己作为喹乙醇的替代产品广泛应用于畜牧业生产。虽然喹赛多的毒性远低于传统的喹噁啉类药物，但它在动物组织体内的残留问题仍不容忽视［4-6］。

牛奶中含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等营养物质。2008年1月15日，卫生部发布的《中国居民膳食指南（2007）》介绍了新版《膳食宝塔》凸显牛奶价值，牛奶是摄取营养元素的催化剂以及健康的关键，是健康膳食的基石［7］。随着生活水平的提高，因其丰富的营养成分，牛奶成了日常生活中不可或缺的必需品。随着奶牛饲养过程中抗菌及促生长兽药的使用［8］，牛奶也会被污染。文献［9，10］报道了饲料及肉中喹噁啉类药物残留的测定，而牛奶中喹赛多残留的测定鲜见报道，利用超高效液相色谱串联质谱技术建立了测定牛奶中喹赛多残留的方法，该法具有操作简单、回收率好等特点。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂

QTRAP 4500质谱分析仪（美国AB SCIEX）；Agilent 1290高效液相色谱仪（美国安捷伦）；高速冷冻离心机（湖南赫西仪器）；振荡器（常州金坛恒丰仪器制造有限公司）；旋转蒸发仪（德国IKA）；氮吹仪（Reeko Auto EVA-30）；电子天平（METTLER，0.01 mg）；均质器；Agela Technologies Cleanert PAX固相萃取小柱（60 mg/3 mL）；Agela Technologies Cleanert PEP固相萃取小柱（60 mg/3 mL）。

液态牛奶，市购；喹赛多标准物质（97%）；甲醇、乙酸乙酯（色谱纯，美国JT Baker）；甲酸（优级纯）；氯化钠（分析纯）；正己烷（优级纯）；试验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制准确称取一定量的喹赛多标准品，先用少量的二甲亚砜溶解，再用甲醇定容，混匀，得到浓度为19.2μg/mL的储备液，于4℃避光保存。

1.2.2 样品提取取10 g均质好的牛奶样品于50 mL离心管中，加乙酸乙酯20 mL，振荡15 min，5 000 r/min离心10 min，取乙酸乙酯层于鸡心瓶中。再加20 mL乙酸乙酯重复提取1次，合并2次提取液，于40℃水浴旋转蒸发至干。用5 mL 4%氯化钠溶液溶解残留物，加5 mL正己烷振荡混合1 min，静置分层，弃去正己烷。再加正己烷5 mL，重复提取1次，取下层液备用。

1.2.3 样品净化 PAX及PEP小柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，取备用液分别过PAX及PEP固相萃取小柱，用3 mL水淋洗抽干，再用3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于40℃下氮气吹干。用1.0 mL甲醇溶解残留物，涡旋混匀，过0.22μm滤膜，供超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定。

1.2.4 仪器条件

1）色谱。岛津Inertsil ODS-3柱（3μm，2.1 mm×100 mm）；流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为乙腈-甲醇（3∶11），梯度洗脱程序见表1；流速0.30 mL/min，分析时间5 min，进样体积5μL，柱温30℃。

表1 流动相梯度洗脱

2）质谱。离子源为电喷雾离子源（ESI+）；正离子模式扫描；多反应监测（MRM）；电离电压4.5 kV；多反应检测（MRM）；离子源温度450℃；喷雾器压力275.9 kPa；辅助加热气241.4 kPa；气帘气压力241.4 kPa；其他参数见表2。

表2 喹赛多质谱参数

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

根据待测物的性质，使用喹赛多标准应用液在ESI+模式下分别进行质谱条件优化。选择药物响应强度最高的m/z值作为母离子，进行子离子扫描，并优化去簇电压和碰撞电压，在MRM模式下优化气帘气压力、离子源温度、喷雾器压力、辅助加热气。

2.2 色谱条件优化

选择流动相时考虑到是ESI+模式，所以使用了0.1%甲酸水，有机相分别试验了甲醇、乙腈及两相混合的效果。单一使用甲醇为有机相时，峰形展宽、拖尾，单一使用乙腈为有机相时，基线噪音增大。综合考虑，选择甲醇-乙腈混合作为有机相并试验了不同比例对试验结果的影响，最终确定（3∶11）乙腈/甲醇-0.1%甲酸水为流动相。图1为1.920μg/mL的喹赛多标准溶液MRM谱。

图1 喹赛多标准MRM谱

2.3 提取溶剂的选择

试验重点对比了不同的提取溶剂，包括乙酸乙酯、乙腈-乙酸乙酯（1∶9）、乙腈-乙酸乙酯（2∶8）、乙腈-乙酸乙酯（5∶5）等的提取效果。试验发现，采用乙酸乙酯提取杂质较少，提取效率高，毒性小，易挥干，故最终选择了乙酸乙酯为提取溶剂，且采用了正己烷脱脂后再用小柱净化。

2.4 固相萃取小柱的选择

试验进行了0.384、0.960、1.920μg 3个水平的加标回收试验，比较了PAX及PEP两种固相萃取小柱对喹赛多的保留能力。结果表明，PEP固相萃取小柱3个水平的回收率均较好，而PAX固相萃取小柱只有低水平回收率高于50%（表3），最终选择PEP固相萃取小柱进行样品净化。图2为喹赛多标准经过PEP固相萃取小柱净化的MRM谱。

表3 两种固相萃取柱的回收率

图2 PEP固相萃取小柱净化的MRM谱

2.5 标准曲线及检出限

用甲醇将喹赛多标准储备液制备成含喹赛多分别为0.384、1.152、1.920、3.840、11.520、19.200μg/mL的标准工作溶液，在确定的分析条件下以标准溶液质量浓度为横坐标，喹赛多响应值之比为纵坐标绘制标准曲线，得到线性方程为Y=46 469.3x+8 879.3，相关系数为0.999 0，检出限为0.01μg/g。

2.6 精密度及准确度

取不含喹赛多的牛奶样品分别过PAX及PEP固相萃取小柱进行三水平加标回收试验，结果见表4。由表4可知，PAX固相萃取小柱回收率在10.1%～27.3%，效果不理想，而PEP固相萃取小柱在3个水平的加标回收率均能达到62.6%以上。结合上述固相萃取小柱回收试验，说明PEP固相萃取小柱适宜于牛奶中喹赛多残留的测定。图3为牛奶样品添加喹赛多的MRM谱。