不同施肥处理对小麦根际土壤真菌多样性及根腐病的影响

刘东海，张学江，王 鹏，胡 诚，乔 艳，张 智，李双来

（1.湖北省农业科学院植保土肥研究所，武汉 430064；2.枣阳市农业技术推广中心，湖北 枣阳 441200）

土壤微生物是土壤生态系统中极其重要的组分［1］，通过参与有机质的降解、腐殖质的形成和土壤养分的转化循环等途径维持土壤肥力和作物生产力，是反映土壤环境的重要敏感指标［2，3］，同时土壤微生物的数量和活性与植物发病率有密切的关系［4］。小麦（Triticum aestivumL.）根腐病是重要的土传真菌病害，在世界各地广泛分布，在小麦整个生育期都可发生根腐病害。该病害由麦根腐平脐蠕孢（Bipolaris sorokiniana）［5，6］、镰刀菌（Fusariumspp.）［7，8］等多种土壤病原菌单独或复合侵染引起，严重影响小麦生长发育、产量和品质［9］。在澳大利亚［10］、美国西北太平洋地区［11，12］，黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）是当地小麦根腐病的主要病原菌；中国黄淮麦区、西北地区根腐病的优势致病菌是根腐平脐蠕孢菌［13-15］。施肥是农业生产的主要措施之一，长期施肥可改变土壤理化性质和生物活性，影响作物产量［16］以及土壤养分微生物生物量及功能多样性［17，18］；施肥也影响麦类根腐病害的发生，刘欢欢等［19］指出生态炭肥对小麦根腐病的防效及对土壤健康修复作用存在正剂量效应。刘苹等［20］指出复合生物有机肥和微生物菌有机肥能有效提高土壤中性磷酸酶活性，促进磷素循环，增强拮抗和有益微生物对禾谷镰孢菌的抗性并促进小麦生长。因此，本试验设置不同施肥处理来研究施肥对小麦根际土壤真菌微生物多样性及根腐病的影响，旨在为小麦根腐病的田间管理提供切实可行的方法。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

2018—2019年在湖北省枣阳市南城办事处后湖村（E112°42′01″，N31°59′41″）开展2季不同施肥影响根腐病害的试验。土壤类型为潴育型水稻土，白散泥田。前茬作物为水稻。土壤有机质含量为23.34 g/kg，有效磷含量为11.21 mg/kg、速效钾含量为92.91 mg/kg，pH 5.49。小麦生育期内大于10℃的有效积温为1 914.2℃；降雨量为219.4 mm；最低气温为-5.9℃；日照时数为853.1 h。小麦生育期早期阴雨，后期干旱。供试小麦品种为鄂麦580。

1.2 试验设计

试验共设4个处理，分别为不施肥（T1）、习惯施肥（T2）、推荐施肥（T3）和有机肥替代50%化肥（T4）处理。重复3次，小区面积105 m2，随机排列。习惯施肥施肥量N为195 kg/hm2，P2O5为67.5 kg/hm2，K2O为60 kg/hm2。推荐施肥和有机肥替代化肥处理施肥量N为150 kg/hm2，P2O5为60 kg/hm2，K2O为5 kg/hm2。供试肥料氮肥为尿素（N，46%），磷肥为过磷酸钙（P2O5，12%），钾肥为氯化钾（K2O，60%）；商品有机肥（湖北双港农业科技贸易股份有限公司），养分含量N、P2O5、K2O分别为3.57%、3.38%、3.92%。

10月20日机械条播，行宽27 cm，播种量225 kg/hm2。10月28日灌水抗旱，12月8日化学除草，3月6日防治麦园蜘蛛和蚜虫，3月27日破口抽穗，4月6日齐穗，4月11日每公顷用戊唑·多菌灵悬浮剂1 500 mL对水375 kg防治小麦赤霉病，4月23日用艾美乐防治穗蚜，5月26日成熟收割。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集 于2019年小麦收获后进行土壤样品采集，采样深度为0～20 cm，每个小区按梅花型5点采样，剔除石砾和植物残根等杂物后混合，每个小区的混合土样分为两部分，一部分用于化学指标测试，另一部分放置于-80℃冰箱保存，用于DNA提取和高通量测序。

1.3.2 土壤理化性状分析 碱解氮含量采用碱解扩散法测定，速效磷含量采用紫外可见分光光度法测定，速效钾含量采用火焰光度法测定，有机碳含量采用重铬酸钾法测定，土壤pH采用1∶2.5的水土比、复合电极测定［21］。

1.3.3 小麦根腐病调查 小麦收获期进行根腐病调查，采用五点取样法，每点20株，调查病害的发病情况，计算发病率和病情指数。发病率=发病株数/调查总株数×100%；病情指数=Σ（各级发病数级代表值）/（调查总株数×最高级别代表值）×100%。小麦成熟期根腐病分级标准参照胡艳峰［13］的方法划分：0级，根茎基本无症状；1级，根茎基部有褐色小病斑；2级，根茎基部有梭形病斑；3级，根茎基部梭形病斑延伸扩展或腐烂；4级，根茎基部严重腐烂，植株枯萎。

1.3.4 土壤DNA的提取及MiSeq sequencing测序对不同处理土壤样品采用E.Z.N.A®Soil NDA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提 取 土 壤 总DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。对18S rRNA基因的V3-V4高变区片段进行PCR扩增，引物序列为SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和81196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）。扩增条件：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，25个循环；72℃延伸5 min。每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluor TM-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，按照每个样本的测序量要求进行相应比例的混合。在上海美吉生物医药科技有限公司的Illumina MiSeq PE 250平台分别进行真菌的测序。

1.3.5 数据分析 利用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 20.0软件的Tukey法对试验数据进行统计分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同施肥下土壤真菌群落结构的表征

2.1.1 高通量测序结果及α多样性指数 从图1可以看出，稀释曲线都趋向平缓，说明测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的微生物多样性信息。12个样本共得到真菌539 137个有效序列，平均长度为401.68 bp；所有样本按照最小样本序列数（31 751 reads）进行抽平处理，然后按照97%相似度划分，共得到1域12界33门57纲79目94科102属145种248 OTUs。

图1 真菌稀释曲线

从表1可以看出，不同施肥处理真菌群落丰富度指数从大到小依次为T4、T1、T2、T3，Shannon多样性指数从大到小依次为T1、T2、T4、T3，但2个指标各处理间无显著差异；各处理真菌群落的覆盖度为99.91%～99.92%。由此可知，施化肥在一定程度上降低了真菌的丰富度和多样性指数，施用有机肥增加了真菌的丰富度指数。

表1 不同施肥处理的土壤真菌α-多样性指数

2.1.2 不同施肥处理下真菌门水平群落结构 土壤真菌门水平群落相对丰度如图2a所示。不同施肥导致土壤真菌群落结构聚为3类，T3和T4聚为一类；T2聚为一类；T1单独一类（图2b）。真菌（门水平）群落组成主要是子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota），二者占到群落组成的92.57%～94.55%。其中，子囊菌门在T2处理中的相对丰度最高（85.48%），显著高于T4和T1处理；担子菌门在T1处理的相对丰度最高（21.29%），显著高于T2和T3处理。与有机肥替代50%化肥的T4处理相比，习惯施肥的T2处理显著提高了子囊菌门的相对丰度，但降低了担子菌门的相对丰度。

2.2 不同施肥处理对土壤理化性质、根系活力和产量的影响

图2 不同施肥处理对门水平真菌相对丰度的影响（a）及聚类分析（b）

不同施肥处理对土壤理化性质产生了一定影响，具体见表2。与不施肥处理相比，所有施肥处理土壤pH均有所下降，下降幅度为0.21～0.44个单位，其中习惯施肥处理下降幅度最大，有机肥替代50%化肥处理下降幅度最小。推荐施肥有利于提高土壤碱解氮、速效磷、速效钾和有机碳含量。小麦根系活力从大到小依次为T4、T3、T2、T1。T2和T3处理的产量分别为5 945.40 kg/hm2和5 878.95 kg/hm2，差异不显著；T4处理产量为4 767.15 kg/hm2，显著低于T2和T3，可能是由于当季有效养分不足导致的减产；T1产量最低，为2 402.70 kg/hm2。

表2 不同施肥处理的土壤理化性质及产量

2.3 土壤真菌种水平菌群结构与环境因子分析

土壤真菌种水平群落结构与环境因子分析如图3所示。pH和速效钾聚为一类，有机碳（SOC）和碱解氮聚为一类，速效磷聚为一类。小麦根腐病的致病菌麦根腐平脐蠕孢和禾谷镰刀菌与环境因子的相关性如表3所示。小麦根腐病的致病菌麦根腐平脐蠕孢与土壤碱解氮、速效磷和有机碳含量呈正相关，与速效钾含量和pH呈负相关，但不显著；致病菌禾谷镰刀菌与土壤pH和速效磷含量呈正相关，与土壤有机碳、碱解氮和速效钾含量呈负相关，相关性也不显著。这可能由于稻麦轮作下，减弱了小麦根腐病致病菌与环境因子间的相关性。

图3 真菌种水平群落环境因子分析

表3 根腐病致病菌相对丰度与环境因子的相关系数

2.4 不同施肥处理对小麦根腐病菌及其病情指数的影响

由表4和图4可知，不同施肥处理下的禾谷镰刀菌和麦根腐平脐蠕孢的相对丰度不同，各施肥处理禾谷镰刀菌的相对丰度由高到低依次为T2、T4、T3、T1，麦根腐平脐蠕孢的丰度依次为T3、T1、T4、T2。不同施肥处理的根腐病病情指数从大到小依次为T1、T2、T3、T4。

表4 不同施肥处理对根腐病致病菌及其病情指数的影响

图4 不同施肥处理对真菌种水平相对丰度的影响

3 小结与讨论

本研究发现，施用化肥可降低真菌的丰富度和多样性，与张宇亭［22］研究的结论一致，主要原因为长期施用化肥造成了酸性和中性土壤pH的降低。有机肥替代50%的化肥可增加真菌的丰富度指数，比推荐施肥处理多样性指数高，可能因为有机和无机肥配施可提高微生物群落多样性［23］。因此细菌和真菌群落结构多样性水平等指标可间接地指示土壤肥力及致病能力［24］。

长期不同施肥可以改变真菌群落结构［25，26］。本研究不同施肥量条件下的土壤真菌群落可聚为3类，其中T3和T4聚为一类，T2聚为一类，T1单独一类。施化肥比有机肥替代更能提高子囊菌门的相对丰度，但降低了担子菌门的相对丰度，即施有机肥可提高微生物群落多样性。

不同施肥对土壤基础化学性质产生了不同影响。施用化肥处理降低了土壤pH，施用有机肥减缓了pH的下降，与Zhang等［27］的研究结果一致。有机肥替代50%化肥处理的产量低于推荐施肥和习惯施肥处理。欧杨虹［28］指出低量有机肥氮（25%）替代化肥氮处理的子粒产量与单施化肥氮相当，只有合适比例的有机肥氮部分替代化肥氮施用才能维持高产。李静［29］指出50%NPK+6 000 kg/hm2猪粪处理的产量比单施化肥高，且猪粪的养分含量高于50%NPK才能保障产量。

小麦根腐病已成为世界许多小麦种植区的主要病害之一。根腐病的发病程度与土壤施肥情况有关，Fernandez等［30］和Tinline等［31］发现在低氮情况下，根腐病的发病情况明显减轻，与低氮条件下土壤中镰刀菌的减少有关。本研究不同施肥条件下禾谷镰刀菌在真菌群落中的相对丰度跟施肥量多少相关，从大到小依次为T2、T4、T3、T1，但是与根腐病病情指数并不相符，这是因为根腐病是由复合侵染引起的。T4处理的根腐病指数最低，说明施用有机肥能够降低根腐病发病率，与文献报道有机肥可降低病原菌的相对丰度，进而对土壤致病菌有明显抑制作 用［26，32，33］结 论 一 致。可 能 因 为：有 机 肥 中 的 木霉［34］、枯草芽孢杆菌［35］和放线菌［36］可以抑制致病菌；有机肥中的有机质成分除可通过改善土壤结构修复土壤肥力外，还可以有效地控制土传细菌及真菌病害［37，38］。因此，施用有机肥有利于小麦根腐病的防治。