UPLC-MS/MS测定小麦中八种除草剂和真菌毒素

赵 健，陈 国，章 豪，吴银良

（宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040）

小麦是中国主要农作物之一，在其生长过程中，使用除草剂防治杂草是提升小麦产量和品质的重要手段［1］，但除草剂不科学使用或滥用，会对小麦造成污染。小麦在生长过程被真菌感染，在生长过程和储存过程中不断产生真菌毒素，并通过餐桌被人或动物摄入，产生毒害［2，3］。因此，对小麦除草剂和真菌毒素进行检测，对保证人们的健康具有积极的意义。目前，除草剂和真菌毒素检测方法国内外已有报 道，检 测 仪 器 多 为 气 相 色 谱 仪［4，5］、液 相 色 谱仪［6，7］、气相色谱质谱联用仪［8，9］、气相色谱串联质谱联用仪［10，11］和液相色谱串联质谱联用仪［12-15］等，但现有的检测方法仍以单独的除草剂或真菌毒素为主，同时测定小麦中除草剂和真菌毒素的方法仍较少。本研究基于现有研究，开发出一种同时测定小麦中8种药物（异丙隆、二甲四氯、苯磺隆、苄嘧磺隆、伏马毒素B1、伏马毒素B2、杂色曲霉毒素、T-2）的方法，旨在为粮谷样品快速检测除草剂和真菌毒素提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 仪器

XEVO TQ MS超高效液相色谱串联质谱仪，配ESI，美国Waters公司；model 9860超声波清洗器，天津科贝儿光电技术有限公司；氮吹仪，美国Organomation公司；PL3002电子天平、XPE205电子天平，Mettler Toledo；离心机，德国SIGMA公司；KS4000ic控温摇床，德国IKA公司；匀浆仪，德国IKA公司；LM3310实验磨，瑞典Perten公司。

1.2 试剂

甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯；石墨化碳、N-丙基乙二胺、硅胶，上海安谱实验科技股份有限公司；异丙隆、二甲四氯、苯磺隆、苄嘧磺隆为德国Dr.Ehrenstorfer；伏马毒素B1、杂色曲霉毒素、伏马毒素B2、T-2为加拿大TRC，纯度均大于95%。小麦样品粉碎，储存于-20℃。

1.3 方法

1.3.1 标准储备溶液的配制 分别准确称取异丙隆、二甲四氯、苯磺隆、苄嘧磺隆、伏马毒素B1、伏马毒素B2、杂色曲霉毒素、T-2药物固体标样，乙腈溶解配制100 mg/L储备液，-20℃保存。再移取各储备液配制成2 mg/L标准工作液。

1.3.2 提取溶液的配制 准确量取850 mL乙腈、140 mL超纯水和10 mL甲酸，混合均匀，配制成乙腈-水-甲酸混合溶液。

1.3.3 样品提取与净化 准确称取小麦空白样品5.00 g于50 mL塑料离心管中，准确加入20 mL乙腈-水-甲酸混合溶液，匀浆仪上10 000 r/min匀浆2 min，振荡10 min后超声2 min，离心5 min（9 000 r/min）。准确移取5.00 mL上清液至装有30 mg石墨化碳的10 mL塑料离心管中，涡旋振荡1 min后，离心3 min（9 000 r/min），准确移取4.00 mL净化溶液于另一个10 mL试管中，氮气流下40℃水浴浓缩近干，残液用1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液（V/V，5/5）溶解，过0.22μm滤膜，上仪器检测。

1.3.4 基质标准溶液的配制 称取不含待测药物的小麦空白样品，按“1.3.3”的提取和净化方法得到空白基质，用其稀释2 mg/L标准工作液，依次稀释至100、50、20、10、5、2μg/L，现配现用。

1.3.5 液相条件 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Shield RP18，2.1 mm×100 mm，1.7μm；色谱柱40℃；样品室20℃；流动相A为乙腈；流动相B为0.1%甲酸水溶液；进样体积10μL；梯度见表1。

1.3.6 质谱条件 离子源采用电喷雾离子源（ESI）正、负离子模式；检测方式为多反应监测（MRM）；电离电压3.0 kV；雾化气流速1 000 L/h；锥孔气流速30 L/h；离子源温度150℃；雾化温度500℃；各化合物的质谱采集参数见表2。

表1 流动相梯度

表2 MRM质谱采集参数

1.3.7 基质效应 通过试剂和基质空白溶液配制的标准溶液线性回归曲线斜率的比值，考察分析物的基质效应。当斜率比超出0.8～1.2时，不适合使用试剂标准溶液定量。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

8种药物均溶于乙腈和甲醇，鉴于乙腈具有更好沉淀蛋白质的作用，选择乙腈作为提取液中的有机相；小麦样品含水量较低，并且部分药物含有酸性基团，为提高回收率，提取液中加入适量水或酸性水溶液。为此，试验考察了乙腈-水（85/15，V/V）、乙腈-水（50/50，V/V）、乙腈-水-甲酸（85/14/1，V/V/V）、乙腈-水-甲酸（50/49/1，V/V/V）4种提取液对8种药物的回收率和提取效果，并通过基质外标法进行计算。结果表明，当使用没有甲酸的提取溶液进行提取时，伏马毒素B1和伏马毒素B2等药物回收率低至50%以下，在使用含有甲酸的提取溶液进行提取时，所有药物回收率均在75%～110%，为便于浓缩提高灵敏度，最终选择乙腈-水-甲酸（85/14/1，V/V/V）作为提取溶剂。

2.2 净化材料的选择

小麦富含糖和蛋白质，其种皮也含有多种色素，酸性提取液偏黄色。为更多地去除提取液中杂质，降低基质效应，减少对仪器污染，筛选了硅胶、石墨化碳和N-丙基乙二胺等作为净化材料净化提取液。结果表明，当提取溶液为乙腈-水-甲酸（85/14/1，V/V/V）时，适量N-丙基乙二胺和硅胶作为净化材料，回收率均可控制在70%～110%，但不能有效去除色素；石墨化碳能有效去除色素，当5.00 mL提取液中使用30 mg石墨化碳时能取得较好的净化效果，回收率控制在70%～120%。因此，最终选择石墨化碳作为净化材料，使用量为30 mg。

2.3 色谱条件的优化

8种药物在色谱柱上的分离度及灵敏度与流动相有很大的关系。为增强药物的电离度，得到更好的灵敏度，试验对比了有机相为甲醇和乙腈，水相为纯水和0.1%甲酸水溶液的4套体系，并优化有机相和水相梯度。结果表明，甲醇、乙腈加纯水作为流动相时，伏马毒素B1和伏马毒素B2等药物峰形较差；在流动相中加入甲酸，所有药物均能得到较好的峰形，当有机相为乙腈时，药物灵敏度和峰形均优于甲醇作流动相，所以最终选择乙腈-0.1%甲酸水体系。

2.4 质谱条件的优化

将8种药物用乙腈稀释配制成1 mg/L标准溶液，流动相采用乙腈+0.1%甲酸水溶液，通过自动泵使标准溶液和流动相混合注入质谱，对化合物质谱条件进行优化。通过全扫描确定8种药物的母离子，二甲四氯的电离化模式为ESI-，其他药物的电离化模式为ESI+。在负离子模式下，二甲四氯可产生稳定灵敏度高的［M-H］-母离子；在正离子模式下，发现异丙隆、苯磺隆、苄嘧磺隆、伏马毒素B1、伏马毒素B2、杂色曲霉毒素可形成稳定灵敏度高的［M+H］+母离子，T-2形成的［M+H］+灵敏度偏低，但可得到稳定灵敏度高的［M+Na］+和［M+NH4］+母离子，在正离子模式下母离子为［M+Na］+时灵敏度和信噪比更高。在确定各化合物母离子后，应用仪器自带的Intelli Start技术对药物进行质谱参数优化，得到药物的定量和定性子离子，并确定相应的锥孔电压和碰撞能量，最终建立8种药物的多反应监测方法。

2.5 方法学验证

2.5.1 基质效应 小麦富含各种营养成分，提取液虽经石墨化碳净化，但残留的杂质仍可能具有较强的基质效应，影响药物的检测结果。为评估基质效应，分别用试剂和小麦基质空白溶液配制2～100μg/L混合标准工作溶液，通过仪器分析后，用得到的线性回归曲线计算斜率比值，结果见表3。由表3可以看出，异丙隆、苯磺隆、苄嘧磺隆、二甲四氯等药物表现为基质效应增强，T-2表现为基质效应抑制，5种药物斜率比均超出0.8～1.2的阈值，说明小麦样液中仍有较强的基质效应。为此，最终选择基质标准溶液定量。

表3 溶剂标液和基质标液的线性回归方程和斜率比

2.5.2 方法定量限和线性关系 用小麦基质空白配制8种真菌毒素和除草剂的系列混合标液，质量浓度依次为2、5、10、20、50和100μg/L。结果表明，8种药物在质量浓度为2～100μg/L时，相关系数为0.997 2～0.999 9，线性关系良好。采用小麦空白样品添加，10倍信噪比时添加浓度作为方法定量限，结果如表4所示，8种药物定量限在0.4～2.0μg/kg。

2.5.3 回收率与精密度 称取小麦空白样品进行回收试验，3个水平的添加浓度依次为5、20、80μg/kg，每个水平重复5次。结果表明，8种药物的平均回收率为76.4%～114.0%，相对标准偏差为1.8%～9.2%（表4）。色谱见图1至图3。

图1 基质标液MRM色谱

图2 样品空白MRM

图3 添加样品MRM

表4 8种药物的添加回收率、相对标准偏差和定量限

3 讨论

小麦中除草剂和真菌毒素能同时检测的方法较少，本试验选择了4种在用除草剂和4种小麦易产生的真菌毒素作为研究对象。考虑小麦营养成分和8种药物分子结构差异，筛选并优化了提取溶液的组成、净化材料及其使用量，以及液相色谱和质谱仪器条件，建立了QuECHERS-超高效液相色谱串联质谱仪同时测定小麦中8种除草剂和真菌毒素的分析方法。在方法验证中，通过对基质效应评价，确定采用小麦基质空白配制标准溶液进行外标法计算，8种药物在线性范围内均具有良好的线性关系，所有药物平均加标回收率为76.4%～114.0%，相对标准偏差为1.8%～9.2%，定量限为0.4～2.0μg/kg。该法简单、灵敏度高、重现性好，满足分析的要求，适用于小麦中8种药物定性定量快速检测。