猪MMP20基因变异筛选及其与母猪繁殖性状的关联分析

吴俊静，董斌科，乔 木，梅书棋，彭先文

（动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室/湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430064）

猪的繁殖性状是直接关系到养猪业的经济收益的重要经济性状，尤其是猪产仔数性状，提高母猪产仔数对提高养猪业的总体经济效益意义重大。然而，母猪繁殖性状多为低遗传力的复合性状，很难用常规育种技术进行遗传改良，所以寻找控制母猪繁殖性状的关键分子遗传标记，应用于该性状的分子辅助育种，对提高母猪繁殖性能具有重要意义。

基质金属蛋白酶-20（MMP20，Matrix Metallopeptidase 20）是基质金属蛋白酶家族中的一员，主要与牙齿发育密切相关，在降解釉原蛋白方面发挥重要作用。MMP20基因的突变可导致釉质发育不良［1］，与龋齿有密切关系［2］。另有文献报道，MMP20基因缺失与神经母细胞瘤有关［3］。以上主要是在人和鼠中的研究结果，有关猪MMP20基因的研究甚少，有关MMP20基因对猪繁殖性能的影响还未见报道。湖北省农业科学院猪育种团队通过全基因组关联分析技术初步筛选发现MMP20与猪繁殖性状相关，为此，本研究扩增了猪MMP20基因序列，利用该序列进行了多态性变异位点的筛选鉴定及与母猪繁殖性状的关联分析研究，以期获得与母猪繁殖性状相关的新分子标记。

1 材料与方法

1.1 试验样品

采集了15头梅山猪（英山县绿源养猪专业合作社）、255头大白猪（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所原种猪场）母猪血样，并收集大白猪群在2011—2017年期间的繁殖性状记录，主要包括总产仔数（TNB，total number born）、产活仔数（NBA，number born alive）、出生窝重（LW，litter weight）、出生个体重（BW，birth weight of piglet）、21日 龄 活 仔 数（NAd21，number alive in 21 days of born）、21日龄窝重（LWd21，litter weight in 21 days of born）。

基因组DNA采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒（按该试剂盒说明书进行操作）提取。

1.2 猪MMP20基因多态性检测

根据猪MMP20基因的基因组序列（GenBank登陆号：NC_010451）设计引物：上游引物：5′-TCTTACAGTAGACCTTGTGCCA-3′，下游引物：5′-TGGCTTGGGACGTTGAACCT-3′。在梅山猪和大白猪中，分别取15头猪的DNA样本混合，进行PCR扩增，PCR反应体系50μL，体系中各组分的浓度为100 ng模板DNA、10×buffer（含Mg2+）4μL、上述上下游引物各0.5μmol/L、2.5μmol/L dNTPs、1UTaqDNA聚合酶。PCR的运行程序为：95℃预热2 min；94℃变性20 s，62～57℃退火40 s（每个循环降低0.5℃），72℃延伸60 s，共11个循环；94℃变性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验后，采用Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化。纯化产物直接送到北京奥科公司进行DNA测序，对比筛选基因变异位点。

1.3 基因分型

利用上述引物，采用上述PCR产物直接测序法在大白猪群中进行基因分型。

1.4 统计分析

采用SAS 9.0软件的GLM模型进行标记的关联分析。所采用模型为：Yij k=μ+Pi+S j+Gk+ei jk，其中Yijk为性状表型值，μ为总体均值，Pi为胎次效应，S j为季节效应，Gk为基因型效应，eijk为随机误差。

2 结果与分析

2.1 猪MMP20基因多态性检测结果

通过对梅山猪和大白猪两个DNA混合样本池进行MMP20基因片段扩增测序，在两个品种猪中均检测到猪MMP20基因第3内含子中2个碱基突变位点，即位于该基因序列第14334 bp处的C＞G碱基突变（g.14334 C＞G）和第14369 bp的T碱基突变（g.14369 C＞T），如图1所示。

图1 猪MMP20基因第3内含子2个碱基突变位点的测序图谱

2.2 关联分析

在255头大白猪群及其共计868条胎次繁殖性状记录中分析了猪MMP20基因2个突变位点（g.14334bpC＞G和g.14369bpC＞T）基因型与母猪产仔数性状的相关关系。结果发现在大白猪群体中g.14334bpC＞G和g.14369bpC＞T两个位点完全连锁，群体中只存在GG/CC、GC/CT、CC/TT 3种基因型。将3种基因型与母猪繁殖性状进行关联分析，结果发现不同基因型的母猪产仔数、产活仔数、出生个体均重及21日龄窝重性状均差异极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）（表1）。GG/CC基因型个体产仔数、产活仔数与21日龄活仔数均显著低于GC/CT和CC/TT基因型个体（P＜0.05），产仔数存在GG/CC＜GC/CT＜CC/TT的关系。虽然，GG/CC基因型个体的出生个体重显著高于GC/CT和CC/TT基因型个体（P＜0.05），但出生窝重显著低于GC/CT和CC/TT基因型个体（P＜0.05）。

表1 猪MMP20基因突变与母猪繁殖性状的关联分析统计结果

3 小结与讨论

本研究鉴定获得了猪MMP20基因第3内含子中的2个单碱基突变位点g.14334bpC＞G和g.14369bpC＞T。这两个突变位点在基因组上间距35 bp，在本试验检测的大白猪群中完全连锁，仅存在GG/CC、GC/CT、CC/TT 3种基因型。经与母猪繁殖性状的关联分析发现，这两个突变位点显著影响母猪总产仔数、产活仔数、21日龄活仔数、出生个体重和出生窝重等繁殖性状（P＜0.05），并且产仔数性状存在GG/CC＜GC/CT＜CC/TT的关系。因此，MMP20基因第14334 bp处的C等位基因以及第14369 bp处的T等位基因是产仔数的优势等位基因，在育种中应予以保留携带这些优势等位基因的个体，有利于提高群体的产仔数性状。

MMP20是新发现的一种基质金属蛋白酶（MMPs），具有钙离子结合、金属内肽酶活化等功能，参与新陈代谢、蛋白水解等过程。目前该基因的研究多集中于口腔疾病方面，与牙釉质疾病、食管癌、喉癌、舌癌相关［4］。近年来也有研究表明MMP20蛋白与子宫内膜癌及预后不良有关［5］；该基因的突变与卵巢癌发病风险显著相关［6］。但未见报道此基因与繁殖性能相关，但是MMPs在月经周期、排卵、胎盘形成、产后子宫恢复等过程中起重要作用［7］。郭敏等［8］发现子宫内膜异位症患者腹腔液中MMPs水平升高，可能与盆腔粘连的发生及严重程度相关；高扬等［9］也发现MMPs与子宫内膜异位症合并不孕症有关；王卉菲等［10］报道MMPs蛋白参与影响胎盘浅着床过程；MMPs与双胎早产也有密切的关系［11］。有关猪MMP20的研究极少，本研究发现了猪MMP20基因的2个遗传突变位点显著影响母猪繁殖性状，然而其具体作用机制还需要做更深入的基因功能分析与研究。