循环miRNA作为癫痫诊断潜在生物标志物的研究进展

赵海燕，黄颖综述 李永男审校

癫痫是一种常见的危害性极大并且发病机制尚不明确的慢性神经系统疾病，其特征是不可预测性的癫痫发作。由于其致残率高、临床反复发作和病程漫长，严重影响患者的身心健康并且给社会带来经济负担。近年来，通过对循环miRNA表达谱的研究，在癫痫患者和癫痫动物模型中已确定存在100多种不同miRNAs的表达变化，并有证据表明癫痫与循环miRNAs表达变化有关。本文就癫痫患者或癫痫动物模型中差异性表达的循环miRNA及其与癫痫的相关性进行综述。

1 癫痫诊疗现状

全世界癫痫患者有6 500万人，约占世界人口的1%～2%[1-2]。目前，其诊断主要依赖于病史和临床辅助检查[3]，而辅助检查中除在癫痫监测单元中进行长时程动态脑电图外，其他类型的脑电图检测率有限，许多癫痫患者的脑部影像学检查为阴性[4]。目前，大部分癫痫患者经过正规的抗癫痫药物治疗可有效控制，但仍有部分患者不能完全控制，其主要因素之一是癫痫病因的复杂性及异质性。随着2015年精准医学概念的提出，越来越多的学者开始关注如何能做到疾病的精确诊断和靶向治疗。因此，找出有效的生物标志物将有助于对癫痫作出快速正确的诊断和分类，同时为开发癫痫靶向药物治疗提供理论基础。

2 循环miRNA作为癫痫潜在生物标志物

2.1 循环miRNA MicroRNA(miRNA)是内源性18～23个碱基的小片段非编码RNA，作为基因表达的转录后调节因子，主要通过与其靶基因mRNA的3’非翻译区结合，使目标mRNA降解或抑制其翻译，从而实现转录后水平调控基因表达，参与调控个体发育、细胞增殖及分化、细胞死亡、代谢等生物学过程，在基本生命活动中发挥重要作用[5]。存在于血液、尿液、唾液、精液、泪液、乳汁及羊水等体液中的一类miRNA统称为循环miRNA[6]。近年来，循环miRNA因其具有稳定、易检测、经济及无创等特点而备受关注，已成为许多疾病的新型诊断工具[7]。

2.2 循环miRNA作为癫痫潜在生物标志物 在脑组织中，特定细胞类型表达特定的miRNA，这些miRNA是维持其生理特性和细胞骨架所必需的。已发现miRNA在神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞中富集或独特表达[8-9]。合成miRNA关键酶的缺失可导致脑组织结构和功能上的巨大变化，从而导致神经变性和反复痫性发作(即癫痫)的发生，即使一种miRNA的缺失也足以产生明显的中枢神经系统疾病表型[10]。研究发现，在癫痫患者脑组织和癫痫动物模型中发生miRNA表达变化，并且这些变化也可以在循环中检测到[11]。这些研究结果为在miRNA水平对癫痫的诊断和治疗开辟了新的途径，也为癫痫患者的靶向治疗带来新的希望。目前，对癫痫相关miRNA的研究主要是对差异性表达的循环miRNA进行筛选。然而，这些差异性表达的循环miRNA在癫痫的发生和发展的机制尚不十分明确。

3 循环miRNAs表达与癫痫的相关性研究

3.1 miR-134 研究表明，miR-134在大脑中丰富表达，可定位于神经元树突，并负向调节树突棘的大小[12]。Avansini等[13]通过对颞叶内侧癫痫(mesial temporallobe epilepsy，MTLE)14例、局灶性皮质发育不良(focal cortical dysplasia，FCD)13例和正常对照16例的血浆miRNA进行高通量测序分析发现，与正常对照组相比，hsa-miR-134在MTLE患者血浆中显著下调，而在FCD患者血浆中没有下调。为了进一步评估hsa-miR-134作为MTLE生物标志物的稳定性，应用实时定量PCR法验证了65例MTLE患者和83例对照组的独立队列证实，与对照组相比，MTLE患者血浆中hsa-miR-134显著下调。因此，hsa-miR-134的表达下调或是MTLE一种潜在的非侵入性生物标志物。最近的研究表明[14]，通过侧脑室注入红藻氨酸(kainic acid，KA)诱导的癫痫持续状态(status epilepticus，SE)大鼠模型中，miR-134的表达在大鼠海马中显著上调。而应用miR-134拮抗剂后，不仅减少癫痫发作，并且抑制癫痫损伤所诱导的内质网应激和凋亡相关的CHOP、Bim和细胞色素C的表达，还促进海马中环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)的表达。TUNEL和Nissl染色分析亦显示，沉默miR-134的表达，可抑制癫痫所诱导的海马CA3区锥体神经元凋亡及苔藓纤维的异常发芽。在戊四唑(pentylenetetrazol，PTZ)癫痫模型、穿孔途径刺激(perforant pathway stimulation，PPS)癫痫模型等多种颞叶癫痫模型中，沉默miR-134均可起到有效的抗癫痫作用[15-17]。这些研究结果表明，miR-134可能是有效的颞叶癫痫诊断标志物，而抑制其表达是治疗颞叶癫痫的干预措施。

3.2 miR-301a-3p Wang等[18]使用Illumina HiSeq 2000测序发现，30例耐药性患者和30例非耐药性癫痫患者之间血清miRNA存在差异性表达。然后，通过实时定量PCR法在77例耐药性癫痫患者、81例非耐药性癫痫患者和85例健康对照者中验证所选择的miRNA。发现与非耐药性癫痫组和健康对照组相比，耐药性癫痫组血清miR-194-5p、miR-301a-3p、miR-30b-5p、miR-342-5p和miR-4446-3p表达显著下调。其中，miR-301a-3p是鉴别耐药性癫痫和非耐药性最有价值的生物标志物。多元回归分析显示，miR-301a是耐药癫痫诊断的潜在生物标志物，其敏感度为80.5%，特异度为81.2%，且其表达水平下调与癫痫发作的严重程度呈负相关。这一结果表明，血清miR-301a-3p或成为耐药性癫痫诊断的潜在生物标志物。

3.3 miR-106b及miR-146a Wang等[19]使用Illumina HiSeq2000测序筛选30例癫痫患者和30例健康对照组血清中差异性表达的miRNAs。然后，通过实时定量PCR对117例癫痫患者和112例健康对照者中进行验证。发现与对照组相比，癫痫患者血清miR-7d-5p、miR-106b-5p、miR-130a-3p和miR-146a-5p表达上调，而miR-15a-5p和miR-194-5p表达下调。其中，miR-106b-5p对癫痫的诊断价值最高，其敏感度为80.3%，特异度为81.2%。这一结果提示，miR-106b-5p可作为癫痫新的无创性诊断生物标志物。An等[20]招募了90例癫痫患者(其中，57例为全身性癫痫发作，33例为局灶性癫痫发作)和90例健康对照者，通过PCR方法检测了癫痫患者和对照组血清中4种与癫痫相关miRNAs，即miR-106b、miR-146a、miR-194-5p和miR-301a的表达水平。发现与对照组相比，癫痫组血清miR-106b、miR-146a和miR-301a显著上调，而miR-194-5p显著下调。进一步研究发现，血清miR-106b和miR-146a的表达上调水平与癫痫发作严重程度呈正相关，且在血清中两者联合检测对癫痫的预测具有更好的敏感度和特异度。这些研究表明，血清miR-106b及miR-146a可以作为诊断癫痫和评估其严重程度的潜在生物标志物。

3.4 miR-129-2-3p Sun等[21]研究难治性颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy，TLE)患者的颞叶皮质组织与血浆中所表达miRNA的相关性，首先，在手术中切除致痫灶的9例难治性TLE患者的颞叶皮质和8例因高血压颞叶出血而行脑出血清创术所获得的颞叶皮质中，使用Affymetrix miRNA 4.0微阵列法筛选出差异性表达的miRNAs；然后，应用实时定量PCR方法，在13例难治性TLE患者(包括9例用于微阵列筛选的患者)和13例无癫痫发作史及抗癫痫药物接触史的对照者(高血压颞叶出血而行脑出血清创术的患者作对照)的颞叶皮质脑组织中验证所选的差异性表达miRNAs；最后，再通过实时定量PCR检测来自25例难治性TLE患者和25例对照者血浆样品中所选miRNAs的表达水平。结果显示，miR-129-2-3p在难治性TLE患者的颞叶皮质组织和血浆中均表达上调，且随癫痫发作频率的增加，血浆中miRNA-129-2-3p的表达水平也上调，癫痫患者的预后亦差。因此，血浆miRNA-129-2-3p或作为潜在的非侵入性生物标志物，可用于难治性TLE的早期检测和临床预后评估。

3.5 miR-145 研究表明，在SH-SY5Y细胞水平miR-145表达增高，可诱导BCL2相互作用蛋白3(Bnip3)的转录和表达，引起caspase-3和caspase-9蛋白表达增多，进而线粒体自噬受抑制，最终导致SH-SY5Y细胞凋亡[22]。Shen等[23]通过实时定量PCR分析，40例难治性颞叶癫痫患者和42例健康对照者血浆中的miR-145-5p表达水平，发现miR-145-5p在难治性颞叶癫痫患者血浆中的表达明显下调，而且其表达的降低程度与癫痫患者的发病年龄、癫痫发作频率呈正相关。此项研究表明，血浆miR-145-5p可作为难治性颞叶癫痫早期检测和临床评估的潜在非侵入性生物标志物。

3.6 miR-141 近年来，由于miR-141家族具有诱导神经肿瘤细胞凋亡的特点，而作为抑癌基因受广泛关注[24]。在许多癌症中，miR-141的表达水平下调，影响肿瘤细胞凋亡、衰老、增殖和浸润[25]。Liu等[26]通过微阵列分析和实时定量PCR方法，检测皮下注射KA制作的SE小鼠模型血清中miR-141表达水平，发现与正常对照组相比，SE组小鼠血清中miR-141显著上调。在体外细胞癫痫模型中显示，过表达的miR-141可促进caspase-3、caspase-9、Bax及p53蛋白表达和降低细胞沉默调节蛋白1(silent information regulator 1，SIRT1)的表达，并诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖；而应用miR-141拮抗剂则引起与此相反的效果。这一研究结果表明，通过对miR-141在癫痫动物模型中表达水平的变化及其所诱导细胞凋亡通路的进一步探索，血清miR-141或作为癫痫诊断和治疗的生物标志物。

3.7 miR-30a 为了探究癫痫患者在癫痫发作期与癫痫发作间期循环miRNAs的表达差异，Sun等对3例癫痫患者分别在癫痫发作期和发作间期收集血清用于miRNAs表达谱分析。结果显示，与癫痫发作间期相比，在癫痫发作期患者血清中15个miRNA表达上调，10个miRNA表达下调。然后，在90例癫痫患者组成的扩展队列中进行实时定量PCR验证，发现与癫痫发作间期相比，癫痫发作期患者血清中miR-30a、miR-378、miR-106b和miR-15a表达上调。其中，miR-30a的表达上调水平与发作频率呈正相关，而与癫痫发病的性别、年龄、病史长短无显著相关性[27]。因此，血清miR-30a可有助于预测癫痫发作的预后。

4 小结及展望

到目前为止，对癫痫诊断的辅助检查主要是基于脑电图和影像学检查，然而这些辅助检查的阳性率不高，且费用较昂贵。因此，需要寻找经济实惠、简便易行的新型诊断生物标志物。近年来，通过对循环miRNA表达谱的研究，在癫痫患者和癫痫动物模型中已确定存在100多种不同miRNAs的表达变化，并有证据表明癫痫与循环miRNAs表达变化有关。然而，由于游离的循环miRNA生成具有高度异质性，且miRNA的循环环境中存在RNA酶、pH变化等因素，这在很大程度上限制了其作为生物标志物的潜力。如果miRNA被包装在外泌体中，外泌体的膜结构可以有效保护封闭的miRNA免受生物体液中存在的RNA酶的影响，从而使外泌体中的miRNA比游离的循环miRNA更可靠。与此同时，外泌体中miRNA还可直接反映来源细胞的生理、病理及其功能状态[28]，更有助于癫痫的精准诊断和治疗。通过对外泌体中差异性表达的miRNA及其靶基因和相关调控通路的研究，可更好地对癫痫进行诊治。