棉籽壳栽培料常压灭菌生物监测技术及应用*

高春燕，王朝江，李 慧，董文琦，高庆发

（1.河北省农林科学院遗传生理研究所，河北 石家庄 050051；2.灵寿县农业农村局，河北 石家庄 050500）

在食用菌生产时，常压灭菌被广泛应用于熟料栽培和栽培菌种制作过程中，是非常关键的生产环节，直接关系到栽培的成功与否。对常压灭菌效果进行检测的理论方法很多，但由于实用性、可靠性较差且成本高等一些原因限制了其应用。因此目前生产上主要依靠灭菌时间来判定常压灭菌是否达标，但由于灭菌料量等因素的影响，常导致灭菌不彻底。应用常压灭菌生物指示剂可以对食用菌生产中棉籽壳栽培料的常压灭菌效果快速直观监测，使杀菌效率获得稳定提升，进而提高栽培食用菌的生物转化率。

1 棉籽壳常压灭菌指示菌的获得

选用含杂菌较多的栽培料，分散到细菌培养基中，并进行不同时长的常压灭菌处理，筛选出最抗常压灭菌的残留菌。

1.1 杂菌含量高的栽培料配方

选用陈旧棉籽壳和麸皮，按照7∶3的比例将棉籽壳与麸皮混合均匀，烘干粉碎。

1.2 制备含杂菌细菌培养基

含杂菌细菌培养基配方：杂菌含量高的栽培料10%、蛋白胨1.0%、酵母浸粉0.5%、氯化钠0.5%、磷酸氢二钾0.2%、琼脂粉1.5%。

制作时，用水提取栽培料中的杂菌，水用量为欲制作培养基量的70%，制成杂菌悬液；用剩余30%的水预溶其它组分，将菌悬液加入其它组分混合液中；分装试管。

1.3 常压蒸汽灭菌处理含细菌培养基试管

对含细菌培养基试管进行常压灭菌，处理时间从1 h开始，到14 h结束，按等差时长进行不同时长的灭菌处理，最大时长为杀死全部杂菌所需的时间。

1.4 室温下恢复培养残留菌

1.5 拣出最抗常压灭菌的残留菌

拣出达到完全杀菌状态前最后出的单孢菌落，此菌即为最耐常压灭菌的残留菌。将该菌转接到细菌培养基斜面试管上，培养留存。

1.6 检验残留菌在棉籽壳栽培料上的生长能力

将残留菌转接到经高压灭菌的纯棉籽壳培养基上，20℃～24℃温度下培养。该菌在24 h～36 h内能形成明显大片菌落。表示该菌能在环境温度（20℃～35℃）下，在棉籽壳培养基上正常生长。

该残留菌经中国农业微生物菌种保藏管理中心鉴定为枯草芽孢杆菌。

2 指示菌常压蒸汽灭菌效果的能力检验

将残留菌制成麸皮菌剂，把麸皮菌剂和棉籽壳栽培料转接于细菌培养基上，进行常压灭菌，比较二者对常压灭菌的抗力大小。

2.1 制备残留菌麸皮菌剂

麸皮菌剂配方：麸皮、豆粉、磷酸氢二钾、水的配比为 500∶100∶1∶440，混合均匀，121℃灭菌 2 h，接入残留菌。经培养、冷却、干燥、营养细胞灭活等过程，最后烘干至恒重，制成残留菌麸皮菌剂。用平板计数法，把残留菌麸皮菌剂的残留菌芽孢数控制在106个/g。

2.2 检验指示菌常压蒸汽灭菌效果能力

2.2.1 检验用细菌培养基

配方：蛋白胨1.0%、酵母浸粉0.5%、氯化钠0.5%、磷酸氢二钾0.2%、琼脂粉1.5%，制成斜面试管备用。

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2.2.2 检验过程

将0.23 g的残留菌麸皮菌剂和棉籽壳栽培料分别装入制备好的斜面试管中。

对上述试管进行100℃常压灭菌，灭菌时长分别为 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h，灭菌后直接摆放斜面20℃～24℃培养，观察细菌恢复生长情况。

棉籽壳栽培料灭菌3 h或4 h时已无菌长出，麸皮菌剂灭菌7 h或8 h时仍有菌长出，表明残留菌比栽培料杂菌更具有抗常压蒸汽灭菌的能力，即残留菌被杀死时，栽培料中杂菌早已被杀死。证明其具有指示灭菌效果的能力。

3 棉籽壳常压灭菌指示剂的制作

棉籽壳栽培料常压灭菌生物指示剂由芽孢麸皮菌剂和用于指示菌恢复生长的干培养基（无菌）组合而成，分装在100 mL玻璃瓶内，装入后密封。1个玻璃瓶即为1个指示剂。

3.1 繁殖指示菌

培养斜面试管菌种，所用斜面试管培养基为细菌培养基，划线接种，36℃下培养48 h，获得指示菌；将获得的指示菌制成芽孢麸皮菌剂，方法参见2.1，将芽孢浓度调整为109cfu·g-1。

3.2 配制干粉培养基

1个（瓶） 指示剂中干粉培养基按40 mL计，各种材料的重量为蛋白胨0.40 g、酵母浸粉0.20 g、琼脂粉0.80 g、葡萄糖0.20 g，氯化钠0.32 g、磷酸氢二钾0.08 g。

3.3 组配封装

将1个（瓶） 指示剂干粉培养基和0.23 g芽孢麸皮菌剂（干培养基加水后，芽孢浓度106个/mL，无菌保证水平为10-6），放入玻璃瓶内，丁基胶塞、铝盖封口即制成1个（瓶）指示剂。

4 棉籽壳常压灭菌指示剂的应用

棉籽壳常压灭菌指示剂与栽培料袋同时灭菌，灭菌后对指示剂瓶恢复培养，根据指示菌生长情况，判定常压灭菌效果。

4.1 指示剂瓶内注水

灭菌前，用一次性注射器往指示瓶内注入40 mL自来水、蒸馏水、矿泉水或井水均可，摇晃均匀。

4.2 指示瓶与栽培料同时灭菌

将指示剂瓶装入将要灭菌的料袋中间位置，或者挤在料袋中间，含指示剂瓶的料袋或指示剂瓶应放在距蒸汽管道出口较远、位置低、蒸汽最不宜达到的地方，并和栽培料袋一同灭菌。1 t栽培料（干重）建议用2个～3个指示瓶。

4.3 指示瓶培养

灭菌结束后，将指示剂瓶趁热放置在自然环境下温度最高（培养温度20℃～40℃） 且遮阴的地方培养。若出锅时瓶内培养基已经凝固，摆放时则随凝固的形状摆放，使凝固的培养基平面朝上摆放；此时若瓶内培养基还未凝固，需将瓶卧放使其凝固。

4.4 灭菌效果判定

指示剂瓶培养2 d～3 d后，若培养基表面出现大面积近白色不透明的菌落，表明该批次料灭菌不达标；若培养基表面出现单个白色或近白色不透明的菌落，表明该批次料灭菌基本达标；若不出现菌落，表示灭菌达标。对灭菌不达标的栽培料，如已接种应加强通风管理，特别是降低发菌温度，防止杂菌爆发产生危害；未接种的建议重新灭菌；对基本达标的栽培料，也应加强通风管理，降低发菌温度，防止杂菌过快恢复生长。另一方面，再灭菌时，应延长灭菌时间，降低料袋排列紧密程度，增加火力。

经检测玉米芯中的最耐热菌抗热能力略低于棉籽壳，因此本指示剂也适用于玉米芯为栽培主料的食用菌常压灭菌效果监测。本指示技术也可在高压灭菌时应用。