桑树组织培养研究进展及应用

王晓红，韩世玉，罗泽虎，张芳，孙运鹏，吴康云

（贵州省农科院蚕业研究所，贵阳550006）

桑树（Morus alba L.）属多年生双子叶木本植物，是重要的经济树种，其栽培历史可追溯到公元前2800年。桑叶是最能满足家蚕正常生理代谢的饲料，是蚕丝业得以持续发展的重要物质基础，人们栽培桑树主要目的也是为了采收桑叶用于养蚕。除此之外，桑树是一种具有药用保健价值的植物，富含多种植物活性成分，广泛应用于中草药和保健品的开发，其果实——桑椹富含营养与活性成分，而且风味独特，深受人们喜爱。

由于桑树是异花授粉的木本植物，其基因型高度杂合，给桑树育种、资源保护和生理研究带来极大的不便。植物组织培养技术可以加快植物繁殖速度，结合现代生物技术用于遗传育种极大地促进了对植物种质资源的研究与利用。桑树组织培养研究相对于其它植物起步较晚，但发展很快。1968年，日本的大三胜夫[1]首先利用桑树冬芽培养再生植株，经过近半个世纪无数学者不断的研究，桑树组织培养技术快速发展，取得了很多重要的成果。目前，已经建立了桑芽、叶片、子叶、下胚轴、原生质体、花药等组织培养快繁体系，并在桑树育种、生理研究等方面有所应用，已成为研究桑树重要的技术基础。

1 桑树组织培养研究进展

1.1 芽培养

用桑的冬芽、腋芽或顶芽在含有植物激素的MS培养基上，给予适当的温度和光照，可以获得植株。70年代以来日本和我国相继建成了冬芽技术体系。研究发现，在冬芽的离体培养过程中，细胞分裂素是茎叶生长的必要条件，其中6-BA的生长促进作用最强，ZT次之，KT最弱，IAA与GA对培养冬芽的生长几乎无效，ABA 则起抑制作用[2]。Hossain等[3]用MS+BA 0.5～5.0 mg/L培养基再生出了10年生植株，并发现腋芽增殖率随着BA的浓度增加而增加，但超过2.5 mg/L就会抑制芽的生长。当BA浓度为1.0 mg/L，外植体的生长长度达到最大；而浓度为2.5 mg/L时每个外植体增殖得到的芽的个数最多（7.5）。Zaman等[4]将外植体置于MS+6-BA1.0 mg/L+Kin1.0 mg/L培养基中培养单个外植体增殖得到的不定芽数量达到最大；IAA和IBA对于冬芽的生长同样被证明极为有效。最近，魏佳等[5]以桑树带腋芽的茎段为外植体，通过对培养基激素浓度的优化，筛选出药桑的增殖芽继代培养基为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.10 mg/L，滇桑的增殖芽继代培养基为MS+TDZ 0.1 mg/L，川桑的增殖芽继代培养基为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，印度桑K2的增殖芽继代培养基为MS+TDZ 0.05 mg/L。4份桑种质资源的无菌幼苗茎段继代培养45 d后，产生的增殖芽数达到1.6～6.8个，再生幼苗株高可达4 cm以上，分别转移至筛选的生根培养基MS+IBA0.5 mg/L或MS+IBA1.0 mg/L中培养。除川桑再生幼苗的生根率（41.7%～45.8%）和移栽成活率（40%～50%）较低外，其他3份桑种质资源再生幼苗的生根率均可达90%以上，移栽成活率为100%。冯蔚等[6]以农桑14号冬芽为外植体，通过不同生长调节剂浓度配比，筛选出最适的芽增殖培养基为WPM+NAA0.1 mg/L+6-BA0.6 mg/L，在此条件下，桑树冬芽膨大明显，可略见叶形，有大叶长出。李镇刚等[7]在MS+6-BA3.0 mg/L+GA30.5 mg/L的培养基上成功诱导滇桑冬芽萌发，已萌发的小芽在MS+6-BA1.0 mg/L+GA30.2 mg/L的培养基上能正常生长，转移到1/2MS+IBA0.5 mg/L培养基能生根成活，初步建立了滇桑的无性繁殖技术体系。新疆药桑的冬芽能够在MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培养基上生长，并在1/2MS+IBA 0.5 mg/L培养基上能生根成活[8]。

除了激素以外，其他一些重要成分对芽培养也有很大的影响。Yamanouchi等[9]研究了无机氮源对不定芽形成的影响，将从冬芽中分离出的叶置于不同浓度的铵离子、硝酸盐金属离子的培养基中培养，发现无机氮影响了不定芽的形成、叶片的生长及形态。Zaman等[10]将桑树的芽置于MS+6-BA1.0 mg/L培养基中培养，研究不同的氨基酸对芽增殖的影响，发现脯氨酸是体外芽的增殖必要的成份，酪氨酸比脯氨酸更加有效，然而谷氨酰胺抑制增殖。另外，还有学者对冬芽的培养方式进行了研究。Katagiri等[11]从冬芽中取出嫩叶片，将其置于MS液体培养基中进行转速为150 rpm振荡培养，然后将外植体转入固体培养基中继续培养。结果表明，使用MS+6-BA 2.0 mg/L+丙氨酸100 mg/L培养基进行振荡培养对于诱导不定芽的效果非常明显。Tewary等[12]将桑树顶芽和腋芽置于 MS+Kin 0.5～2.0 mg/L培养基中120 rpm振荡培养6周。在前4周当中，可见芽的萌发和延伸，并在接下来的2周中对其进行生根培养，这种使用一种液体培养基连续培养获得试管苗是一种节省劳力、成本的方法。

1.2 叶片、子叶、下胚轴培养

对于桑树叶片组织培养的研究已经积累了大量经验。Bhau等[13]将桑树无菌苗的叶片、茎尖、叶柄外植体在MS+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA0.5 mg/L培养基上诱导愈伤组织，试验证明，叶片是诱导愈伤组织最好的外植体。Oka等[14]研究了BA对诱导叶片形成丛生芽的影响，反映出BA对于叶片的生长有促进作用。2000年，张和禹等[15]以无菌的桑树组织培养苗叶片为材料，通过正交试验研究了5种不同因素（IAA、NAA、BA、KT、agar）配合使用对桑树叶片的不定芽分化率的诱导，筛选出了诱导桑树叶片不定芽分化最佳的培养基为MS+IBA 0.2 mg/L+BA 2.0 mg/L+KT 5.0 mg/L+琼脂6 g/L。王彦文等[16]对叶片愈伤组织的诱导及不定芽分化影响因素进行了深入的研究。他们通过正交试验，探讨了植物生长调节剂TDZ、NAA、桑品种、叶龄、叶位等五种因素对桑树叶片愈伤组织诱导的影响，筛选出了桑树叶片愈伤组织诱导的最佳条件为：选取21 d苗龄的“陕305”组培苗叶片，在MS+TDZ1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基上进行诱导。在此条件下，愈伤组织诱导率可达93.9%。对得到的叶片愈伤组织进行了不定芽分化诱导。结果表明，最佳分化培养基为MS+TDZ 3.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L+2%果糖，愈伤组织不定芽分化率高达100%。

子叶和下胚轴同样可作为外植体诱导愈伤组织进行再生培养。Kim等[17]使用子叶、下胚轴在含有较高浓度BA（有或者无NAA）的培养基中诱导出了不定芽，证明了子叶和下胚轴具有再生能力。2001年，周安莲等[18]以子叶为材料，诱导子叶产生愈伤组织，发现MS培养基附加2，4-D 2.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+6-BA1.0 mg/L诱导效果最好，愈伤组织形成率最高达87.5%。王茜龄等[19]以桑的子叶、下胚轴作为外植体，并将子叶等分为子叶尖部、子叶中部、子叶基部（靠近胚芽的一段），将下胚轴等分为下胚轴上段（靠近胚芽的一段）、中段、下段，置于培养基中培养。结果表明，子叶基部与下胚轴的上段离体再生效果好，子叶基部的离体再生成苗率可以达到63.5%，下胚轴上段的离体再生成苗率为47.1%。同时还发现分区子叶和分段下胚轴都是越接近胚芽生长点的部位用作外植体，其诱导出芽的时间短，并且能很好地分化再生成苗。

1.3 生殖器官培养

花药与胚培养是将桑树的花药（包括花穗或花粉）、胚（包括胚珠等）接种到适宜的培养基上，诱导形成愈伤组织，或直接诱导产生胚状体，进一步培养为再生植株。通过花药和子房培养形成单倍体植株，可以快速获得纯系，缩短育种时间。

1.3.1 孤雄生殖 林寿康等[20]首先就桑树花药培养进行了系统的研究。在供试的5个品种中，以团头荷叶白的胚状体诱导率和国桑21号的分化成苗率较高，认为花粉发育至单核靠边期是花药培养的取材适期。诱导花药内花粉细胞形成小胚状体的适宜培养基为MS+BA1-2 ppm+IBA1-2 ppm，当小胚状体发育至子叶型时转移其分化，成苗率最高，可达20%以上，无根幼苗经继代培养及诱导生根即可发育为完整植株。经幼叶染色体鉴定证实，花药培养植株中约9%的个体为单倍体植株。Sethi等[21]使用MS+IBA5-10 μM+BAP5-15 μM培养基接种花药，在黑暗下保持15 d，其中一个品种“Cv.RFS-175”的诱导率达到了1.82%，表明黑暗是诱导花药的重要的条件。Katagiri等[22]以每毫升106个花粉细胞的密度悬浮培养于含0.1 M的不同糖类或糖醇类的1/2 B5附加5 mM谷氨酰胺、0.4M甘露醇、l ppm BA和l ppm IBA培养基中，放置在28℃的暗处培养。结果表明，不同糖类和糖醇类作碳源对花粉分裂的诱导作用不同，双糖比单糖的效果要好，其中果糖对花粉分裂诱导作用最明显，这种分裂现象几乎和生长在侧芽花序中花粉分裂现象相类似，而木糖和乳糖对花粉分裂的诱导作用要比生长在侧芽中的花粉分裂旺盛得多。Jain等[23]将单核期的花药培养6～20 d即看到有微孢子分裂，将孢子再转接于MB+NAA 0.5 mg/L+BA 1.0 mg/L+8%蔗糖培养基中进行愈伤组织的诱导；在培养基MB+NAA 0.5 mg/L+BA 1.0 mg/L+肌醇75 mg/L中进行生根培养，细胞学鉴定出愈伤组织为单倍体。

1.3.2 孤雌生殖 目前对桑树子房组织培养研究的较多。Sita等[24]用子房培育得到了完整植株，他们在花序形成桑椹之前采下子房，在MS培养基中培养，最终获得了65个植株，其中加入了14.4 μM BAP和4.6 μM Kin的培养基中培养获得了由单个子房发育得到的植株。Thomas等[25]也用未受精的子房获得了单倍体植株，他们培养花序3周后，将单个子房接入MS+4.5 μM 2，4-D+甘露醇500 mg/L+脯氨酸200 mg/L培养基中，16%的子房成苗，有60%的植株为单倍体，其余的却为非整倍体。Thomas[26]又直接将生长了4周的花序切成含有4～5个小花的小片接种在MS+8.5 μM BAP+4.5 μM 2，4-D培养基上培养3周再转接入MS+4.5 μM 2，4-D+甘氨酸500 mg/L+脯氨酸200 mg/L培养基，诱导率达到了16%。此外，也有人对次生胚胎发育进行了研究。其中Agarwal等[27]对桑树的体细胞胚次生胚胎发育和成熟进行了研究，在MS+2，4-D 2.0 mg/L+BAP 0.50 mg/L培养基中培育合子胚得到原始体细胞胚，然后接种于MS+2，4-D 0.05 mg/L+BAP 0.1 mg/L+6%蔗糖培养基上诱导次级胚胎，诱导率达到了98.9%，其中17%为完整的含子叶的胚胎。

1.4 原生质体培养

植物原生质体是去除了细胞壁后被质膜所包围的、具有生活力的“裸露细胞”，能在适宜的培养条件下诱导再生植株。由于没有细胞壁的障碍，原生质体能够直接高效地摄取外源DNA或遗传物质、各种细胞器甚至细胞核，也可与异源原生质体经诱导融合形成体细胞杂种，其培养技术与有关的细胞、分子和遗传等学科的交叉渗透，使植物原生质体的研究越来越受到重视。

原生质体培养能否成功的关键在于对材料的酶解。陈爱玉等[28]对桑树原生质体培养技术进行了多年的研究，建立了一个有效的原生质体培养体系。他们选用桑子叶、桑幼叶、悬浮培养细胞、愈伤组织四种材料，分别进行了原生质体的分离方法及有关条件的研究，结果在适宜酶溶液浓度下，桑原生质体的释放速度和产量顺序为子叶＞幼叶＞悬浮培养细胞＞愈伤组织。此外，他们对提取桑叶原生质体的酶解时间、纤维素酶的用量进行了初步研究。酶液中纤维素酶的用量不宜低于3%，25℃的温度下酶解5～6 h，原生质体数量达到最高峰[29]。Futoshi等[30]也对酶解条件进行了探索，他们研究发现ES5酶系（3.0%纤维素酶，0.1%果胶酶，1.0%离析酶和1.0%木纤维素酶）的作用效果最好，最佳作用时间4 h。还发现以子叶作为外植体得到的原生质体的产量要高于成熟的叶片，使用ES5酶系处理子叶得到了6.2×107个原生质体的高产量。

要对分离得到的原生质体进行培养获得完整的再生植株，培养基的使用和培养条件十分关键。卫志明等[31]以30～45 d苗龄的无菌苗叶片为材料，经适当酶处理获得原生质体，将其培养在KBP+2，4-D 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L+BA 0.5 mg/L液体培养基中。培养密度为5×l04个/mL，黑暗（25±1）℃下用液体浅层、静置方法培养。培养第4 d原生质体的再生细胞有15%以上进行第一次分裂，第10 d时统计分裂频率为24%，在5～6周后形成了多细胞团和小愈伤组织，植板频率为8%。将其转入MS+NAA 0.1 mg/L+BA 1.0 mg/L培养基诱导芽，分化率达到了35%。幼芽长到4～5 cm高时切下，转到1/2MS生根培养基上，经2～3周后可形成具发达根系并生长健壮的完整再生植株。Umate等[32]选取由种子进行组织培养得到的嫩叶作为材料，用2%纤维素酶和1%离析酶混合酶消化细胞壁获得原生质体。培养4 d后开始细胞分裂，用含有2.3 μM玉米素和2.3 μM 2，4-D培养基培养原生质体，诱导率达到了29%，转接到含2.3 μM玉米素和13.5 μM麦草畏的培养基中继续培养，40～42 d后，约有50个细胞长出。转入到MS+4.5 μM TDZ+17.1 μM IAA中继续培养，再以MS+4.9 μM IBA培养基进行生根培养，最终获得完整植株。

1.5 细胞悬浮培养

植物细胞悬浮培养是指植物细胞或小的细胞聚集体在液体培养基中，于摇床上进行悬浮培养。与传统的整株材料相比，植物细胞悬浮体系由于其分散性好、细胞形状及细胞团大小基本相同，而且生长迅速、重复性好、易于控制等有利因素，已成为植物生物技术中十分有用的手段之一[33]。Katagiri等[34]研究发现将叶片在MS+8.8 μM BAP培养基中液体振荡培养相比固体培养，其诱导不定芽生成率提高了1倍。接着，他们从冬芽中取出嫩叶片，将其置于MS液体培养基中进行转速为150 rpm振荡培养，最佳的培养基为MS+BAP 2 mg/L+丙氨酸100 mg/L，对于诱导不定芽的效果非常明显。Shajiahan等[35]将由下胚轴诱导得到的愈伤组织置于MS+2，4-D0.1-1.0 mg/L液体培养基进行悬浮培养，获得了类胚胎，每隔一周更换培养液继代培养。悬浮细胞的细胞质大量富集，分化形成丝状结构，接下来该结构连续分化形成球状和心型结构。李勇等[36]以桑品种粤椹大10诱导出的愈伤组织为接种材料，研究了不同激素对桑树悬浮细胞生长速度的影响。结果表明，在桑树细胞悬浮培养中单因子植物激素NAA最佳浓度为0.5 mg/L，并发现组合因子比单因子更有利于细胞生长，以生长调节剂6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.1mg/L的效果最好。并发现B5+6-BA1.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L液体培养基较适合桑品种粤椹大10细胞的悬浮培养。近年来，王超等[37]以桑品种育-711的愈伤组织为材料，在MS液体培养基中添加6-BA1.5 mg/L+2，4D 0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L能较好地诱导细胞增殖，16 d后细胞数量达到最大。

目前已经有多种农作物和药用植物的悬浮培养研究得较为深入，并进行了广泛的应用。我们较为熟知的西洋参[38]、长春花[39]、飞廉[40]等植物都已建立悬浮细胞系，并进行了活性物质发酵工艺的研究。桑树是一种传统的药用植物，能产生很多重要的生物活性物质，悬浮细胞系的建立和完善，将为利用桑树资源提供一条新的路径。

2 桑树组织培养的应用

2.1 种质资源保存

种质资源是培育优良品种的物质基础和原始材料，妥善保存种质资源并加以利用已成为育种工作的当务之急。随着组织培养技术的发展，很多学者将该技术运用于重要种质资源的保存当中，此种方法具有很多优点和特殊的应用价值。因为培养物可以在培养条件下生存，室内就能繁殖再生成全植株。它的繁殖速度较快，繁殖系数高，繁殖后在基因型上稳定，能表现种质的遗传特性。同时，这种方法还能在较小的场所内保存大量的种质资料，而且成本较低[41]。Enomoto等[42]认为通过组织培养对于珍贵的桑树基因资源的保存非常有效，他成功地再生了24种不同基因型品种的离体芽，并长成了全植株。为了保护长穗桑这一濒临灭绝的具有较高经济价值桑树野生近缘种，姜华武等[43]进行了长穗桑幼叶和茎尖培养的研究，建立了长穗桑组织培养快繁体系。由以上案例可见，组织培养对于桑树种质资源保存的意义极其重大。而随着桑树原生质体培养、细胞培养及桑树组织培养的整体发展，将为种质资源的保存提供更多、更加有效的办法。

2.2 多倍体育种

目前国内外桑树多倍体育种材料只能通过人工途径获得，在国内主要是采用物理辐射方法或者化学诱导方法。这种传统育种周期长，受天气、季节影响大，获得的多倍体桑育种材料也局限在已有的一些地方桑树品种中，基因资源多样化有限。而利用植物组织培养技术和化学诱变相结合的方法获取桑树多倍体育种材料可克服诸多不良影响[44-45]。化学诱变与组培方式的结合，使得多倍体诱导中融入了组织培养的优点。首先试验条件易于控制，由于组培是在室内进行的，在很大程度上降低了外界环境因素对于试验的干扰和影响。其次，可以缩短育种时间。第三，利用组织培养技术可对诱导成功的材料进行快速繁殖，获得更多的多倍体材料。另外由于所选材料大多幼嫩，且处在分生状态的组织细胞，容易受秋水仙碱的影响，诱导成功率较高。同时方便鉴定，在短期内可快速鉴定大批量株系，筛选出多倍体，且多倍体纯度高[46]。

1998年，Chakraborti等[47]首先报道了通过组织培养的方法诱导桑树四倍体的研究。他们将顶芽在含秋水仙素（0.05%，0.10%，0.20%）的MS培养基中处理24 h。当秋水仙素的浓度为0.10%时，四倍体的诱导率最高，达到了（39.4±4.8）%。然后将四倍体芽置于MS+2.6 μM NAA培养基中生根。四倍体芽的再生率达到了80.8%，显示出使用组织培养方法诱导四倍体的可行性。王茜龄[48]对利用植物组织培养技术和化学诱变相结合的方法获取桑树四倍体育种材料进行了连续几年的研究。她采用桑树组织培养技术与秋水仙碱诱变相结合的新型育种方法。试验结果表明，桑树组织培养与秋水仙碱诱导相结合，在试管内可以获得桑树多倍体育种材料。但是材料的种类，秋水仙碱的浓度和处理时间都非常关键，用秋水仙碱直接处理种子、胚轴、子叶，再培养都未获得多倍体植株。用秋水仙碱处理桑组培不定芽，虽然生长缓慢，叶片发生畸变，但经过体细胞染色体计数法鉴定，获得了纯合的桑四倍体植株，其诱导频率可达14%～20%。何健等[49]以长穗桑枝条为外植体，采用组织培养技术和多倍体育种技术相结合的方法，用0.2%的秋水仙素浸泡茎段3 d，然后转入MS+BA0.2 mg/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖30 g/L培养基中，四倍体诱导率最高为16.7%。

化学诱变与组培方法结合常用诱导方式是浸渍法、点滴法和混培法，材料的选取也较为丰富，种子、愈伤组织、丛生芽、幼苗、叶片、茎段、茎尖、体细胞胚胎、胚根皆可，而且诱导离体胚乳也可得到三倍体。因此，今后我们结合组织培养研究桑树多倍体育种，还有比较多的研究方法可供我们选择和研究，以建立切实可行的体系，为育种工作带来帮助。

2.3 人工种子

所谓人工种子，就是将植物组织培养产生的体细胞胚和性细胞胚包在含有营养物质并有保护功能的凝胶胶囊中，形成类似种子的结构并保持种子的机能。人工种子具有诸多优点和发展潜力，譬如不受自然环境的影响，一年四季均可进行，还可节省大面积种子田；繁殖速度快，能大大提高育种效率，缩短育种时间；人工种子可以进行工业化生产，且不存在品种退化；可利用重组DNA、细胞融合等现代生物技术生产出人类所需要的任意优良性状的作物；可在人工种皮中加入天然种子所没有的特殊成分，如加入杀虫剂、除草剂、各种肥等，可使苗木生长健壮且可提高苗木的抗性；节省劳动力并可降低成本[50]。

上世纪80年代，Bapat等[51]就开始对人工桑树种子进行研究。他们将腋芽包埋进含海藻酸盐和琼脂的胶化剂中制成胶囊。该胶囊在4℃下储存45 d没有失去生命力，海藻酸钠经测试为最好的基体，最佳浓度为4%，随后在合适的培养基中培养再生获得了幼苗。90年代，日本的町井博明等[52-54]对桑树人工种子和生长条件进行了连续的研究。他们将不定芽包埋进含3%藻酸钠和100 μM氯化钙的溶液中，制成球形胶囊，在此胶囊中还添加桑生长必要的营养（无机盐、糖、氨基酸）和植物激素等，制成的人工种子种于MS培养基时，发芽生长良好，即使冷藏80 d，也有60%以上的人工种子生长。随后他们研究了不同培养基质（沙、土和蛭石）对于种子生长的影响。结果证明土是最好的基质，种子正常发芽并生根。但直接播种的人工种子在几种基质中均不能生根，而经4℃存放30 d的人工种子都能生根，发芽率达到了50%。2001年，叶志毅等[55]对桑树体细胞胚人工种子的制作进行了探究。他们将经诱导得到的体细胞胚切出小芽，用4%海藻酸钠和1%CaCl2溶液包裹，包裹时间为30 min。对设计的3种人工胚乳的效果进行了测试，其中在海藻酸钠溶液中加入MS+蔗糖250 g/L是最佳组合。将人工播入三种不同的培养介质，其中MS+果糖20 g/L+0.8%琼脂和MS+蔗糖30 g/L+0.8%琼脂较好，它们的发芽率和茎发生率都达到了100%。2008年，Kamareddi[56]对人工胚乳中添加杀菌剂进行了研究。他在胚乳中加入0.1%硫酸链霉素和0.1%苯菌灵，不仅能够抵抗外界的污染物，还能够使胶囊腋芽的发芽率达到60%左右。

目前桑树人工种子仅限于实验室研究，并未应用到实际桑树生产中。由于植物人工种子普遍在包埋方法、人工种皮、人工种子的干化、贮藏和防腐方法这些问题上还有一些不完善，桑树人工种子研究也不多，而且还要考虑桑树自身的生理特性，因此，桑树人工种子的研究还是一项任重而道远的工作。

2.4 转基因育种

通过植物组织培养的方法进行转基因研究，是近年来植物品种改良的重要方法。目前有关桑树转基因报道当中，绝大部分都或多或少利用了组织培养的技术。

自从 1990 年日本学者 Machii[57]通过农杆菌将β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因导入桑树叶盘并在桑苗中表达以来，很多学者在桑树转基因这一领域进行了大量的探索和研究，已取得了一系列的成就。目前，葡萄糖苷酸酶（GUS）基因[57]、抗菌肽基因[58]、大豆球蛋白基因[59]、几丁质酶基因[60]、水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因[61]等外源基因成功转到了桑树中，育成转基因植株。已报道的研究当中，几乎都是以农杆菌为载体介导的外源基因进入桑树。以谈建中等[59]的工作为例，他们以试管苗的幼叶和茎尖作为遗传转化的起始材料，于含大豆球蛋白基因载体的农杆菌菌液中浸渍5～10 min，接种于基本分化培养基共培养，然后将受体材料转移至含抗生素的分化培养基上培养筛选，再生得到小植株，最后通过对转基因植株的PCR-Southern杂交及RNA点杂交等鉴定，证实大豆球蛋白基因转化桑树成功。

目前，桑树转基因受体使用作为成熟且最好的受体材料是丛生芽。2007年，Agarwal等[62]首次比较了使用不同组织培养再生体系进行基因转移的效果。他们将新霉素磷酸转移酶基因（nptII）和β-葡萄糖苷酸酶（GUS）报告基因以农杆菌为介质，分别导入愈伤组织、丛生芽和体细胞胚中再生培养。其中以丛生芽为基因转移的载体效率最高，转化率达到了18.6%。

3 展望

植物组织培养为研究植物生长发育、抗性生理、器官发生及胚胎发生提供了有效途径，已在具有重要经济价值的农作物、花卉及果木中应用。目前桑树组织培养在芽、叶片、花药方面的研究较为成功，而在原生质体、悬浮细胞培养等方面的研究水平还较低。总体而言，桑树组织培养的研究水平与其他一些植物相比较还有一定的差距。从而使桑树组织培养的应用受到一定限制，远远没有发挥其在桑树研究中的重要作用。鉴于桑树组织培养研究现状，在今后的工作中应该加强一下几个方面的研究：（1）加强基础研究，尽快建立不同桑树种质资源的快繁技术体系，加快优良品种的繁育。（2）将桑树组织培养技术与现代生物技术相结合，建立桑树遗传转化体系，将一部分抗病与抗逆基因转入桑树植株，对桑树进行遗传改良。（3）重点研究原生质体培养、花粉和花药培养技术，为桑树倍性育种奠定基础。随着桑树基因组测序计划的完成，桑树的研究即将进入更快的轨道，组织培养是现代作物科学研究必不可少的技术基础，也是现代遗传育种研究的重要路径，可以为桑树多用途综合利用与开发提供技术支撑，必将为桑树科学的发展贡献其应有的价值。