猪肺炎支原体强毒株HNMhy1的生物学特性研究

徐引弟，王治方，张青娴，焦文强，朱文豪，王克领

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002）

猪肺炎支原体是猪支原体肺炎的主要病原。猪支原体肺炎是一种慢性、接触性传染病，具有高发病率和低病死率的特点，主要表现为食欲减退、发热、咳嗽、气喘、呼吸困难等症状，患病猪生长缓慢，饲料转化率下降，常诱发其他病原的感染，特别是免疫抑制性病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型，引起免疫抑制诱导，常因同时继发细菌感染引起死亡，是世界上最主要的猪病之一[1-3]。

本病广泛存在于世界各地，持续感染且难以治愈，同时由于感染猪较高的治疗费用并造成生产性能降低，从而给养猪业造成严重危害。目前国内外均有猪肺炎支原体毒株的报道，有一些较好的疫苗毒株，各有优缺点[4-12]。鉴于此，本研究对从河南本地猪场分离的一株猪肺炎支原体进行了生物学特性研究，旨在为研制具有安全、免疫原性好疫苗以及为猪支原体肺炎的综合防制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 毒株与参考毒株

毒株分离自2017年4月在河南省濮阳市某大型猪场发生重症肺炎呼吸困难的2月龄保育猪的发生实变的猪的肺脏[13]，命名为HNMhy1，保藏编号：CGMCC NO：13858，保藏日期：2017年5月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。参考毒株为猪肺炎支原体J疫苗株，河南省农业科学院畜牧兽医研究所畜禽传染病研究室保存。

1.2 主要试剂和酶

PPLO肉汤粉、酵母粉、琼脂粉购自美国BD公司产品，葡萄糖、酚红购自上海国药集团公司，MEM、马血清购自美国Hyclone公司，青霉素购自华北制药集团公司，L-精氨酸购自Roche公司，2×PCR Mix、DL 2 000 Marker、Ezup 柱式动物基因组 DNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司。氢氧化铝佐剂，F5881，购自Sigma公司，猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒购自美国IDEXX公司。

1.3 试验动物

试验猪为15日龄健康的保育猪，购自河南某猪场，试验前经猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒检测，结果均为阴性。

1.4 增殖滴度试验

将HNMhy1接种PPLO固体培养基，37℃、5%CO2培养箱中培养5 d后，转接PPLO液体培养基，37℃、5%CO2培养箱中培养5 d，取100 μL连续10倍稀释涂布固体平板，37℃、5%CO2培养箱中培养5 d，低倍镜下活菌计数，计算培养物原液菌体滴度。

1.5 毒力试验

试验猪为21日龄健康的保育猪15头，试验动物随机分为3组，未接毒对照组5头，HNMhy1株组5头，J株组5头。将HNMhy1、J株接种PPLO液体培养基，37℃、5%CO2培养箱中培养5 d后，测定菌体滴度，调整至108CFU/mL，试验组动物通过气管注射分别接种3 mL HNMhy1、J株液体培养物，对照组动物通过气管接种3 mL灭菌的PPLO液体培养基。试验期为28 d，每天观察试验动物的临床表现，测量体温、体重，试验结束后剖杀所有试验动物，观察呼吸道病变，采集肺组织病健交界处，研磨，进行病原菌的分离及PCR鉴定。

1.6 免疫原性试验

1.6.1 疫苗的制备 将猪肺炎支原体菌株HNMhy1接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，5 d后收取培养物，测定浓度，调整培养物中猪肺炎支原体的菌数为2×109CFU/mL，每1 000 mL培养物加2 mL甲醛溶液，于37℃灭活12 h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂，混合制得猪肺炎支原体灭活疫苗，疫苗中猪肺炎支原体的菌数约为1×109CFU/mL。

1.6.2 疫苗的安全性试验 选取21日龄健康仔猪10头，均为猪肺炎支原体ELISA抗体阴性。分为2组，每组5头。疫苗组：颈部肌肉注射10 mL本疫苗；对照组：颈部肌肉注射10 mL灭菌生理盐水。观察30 d。

1.6.3 疫苗的效力试验 选取21日龄健康仔猪15头，均为猪肺炎支原体ELISA抗体阴性。分为3组，为：HNMhy1株疫苗组、J株疫苗组、空白对照组，每组5头。疫苗组分别注射疫苗2 mL，空白对照组注射0.5 mL灭菌生理盐水。疫苗组和空白对照组21 d后二免分别注射同等剂量的疫苗和灭菌生理盐水。二免后14 d用109CFU的HNMhy1采取气管注射的攻毒方式进行攻毒。攻毒后28 d内，观察所有猪的临床症状。在攻毒28 d后，对所有猪进行剖检，观察肺部病变。

2 结果与分析

2.1 增殖滴度试验结果

HNMhy1接种 PPLO液体培养基，37℃、5%CO2培养箱中培养5 d，低倍镜下活菌计数，培养物原液菌体滴度为8.0×109CFU/mL。表明HNMhy1增殖滴度高。

2.2 毒力试验结果

试验组动物在接种支原体HNMhy1和J株后10～15 d有明显体温上升趋势，空白对照组体温保持相对稳定，表明HNMhy1感染动物后，体温有一定的影响。感染前后体重变化结果显示，感染猪的日增重明显低于空白组，J株增重最为缓慢，结果表明HNMhy1株感染后，对动物增重有影响。感染猪群在感染后7～14 d逐渐开始表现出口鼻流沫、呼吸困难、咳嗽、喘气等症状，随时间推移症状逐渐加重，减食，张口伸舌、犬坐式腹式呼吸。空白对照组动物在试验期间体温正常且无明显的呼吸道病症状。试验结束后剖杀所有试验动物，采集病料，进行支原体分离。试验组剖检，肺的尖叶、心叶、隔叶部分出现两侧对称性“肉样变”的实变，与周围组织界限明显。对照组剖检均未发生明显的病理变化。对照组的5份病料均未分离到支原体，试验组的5份病料中均分离到猪肺炎支原体，菌落形态表现为“煎荷包蛋样”，PCR鉴定结果与HNMhy1一致。

2.3 免疫原性试验结果

2.3.1 安全性试验结果 观察期间，疫苗组和对照组的仔猪均健康活泼，早晚体温、采食量差异均不显著，未见精神不振、食欲减退、呼吸困难、呕吐、俯卧、震颤等不良反应。说明本发明的灭活疫苗安全。

2.3.2 效力试验结果 疫苗组与未免疫组仔猪攻毒后有明显的差异，攻毒后，未免疫组第2天开始出现临床症状，咳嗽、气喘，呼吸困难、减食；免疫组猪基本正常，无明显的临床症状。剖检结果，免疫组与对照组肺部差异明显，对照组肺脏尖叶、心叶、隔叶部分出现两侧对称性“肉样变”的实变，与周围组织界限明显，而免疫组猪肺组织病变不明显，说明HNMhy1具有良好的免疫原性。

3 讨论

猪肺炎支原体菌株HNMhy1分离自发生典型呼吸困难、肺脏发生实变的保育猪，在PPLO液体培养基中增殖滴度高，达109CFU/mL以上。通常支原体的滴度用颜色变化单位（Colour Change Unit,CCU）来测定，由于猪肺炎支原体可代谢葡萄糖而产酸，因此可以导致液体培养基pH发生变化，加入适当的pH指示剂进行检验，便可应用于间接测定培养物的活单元。这种方法称之为颜色变化单位滴度试验。都是在实际操作中发现，由于加了酚红的培养基在培养箱中几天后颜色会有很大的变化，那么加了支原体的培养基颜色变化不完全是支原体的因素，很多因素对CCU都有影响，而支原体在固体培养基上非常小，必须借助显微镜，因此我们在显微镜下计数，更能准确地进行活菌计数。结果显示HNMhy1株的增殖滴度是很高的[6]。

HNMhy1株对保育猪具有较强的致病力，能够引起保育猪发生典型的喘气病症状，采用的感染方式是气管注射，模拟了自然条件下上呼吸道感染的情况，对仔猪的体温、增重都有明显的影响，表现出咳嗽气喘等症状并逐渐加重，饲料转化率下降明显。解剖后肺脏出现明显的肉样变化，出现典型的支原体感染的临床病理变化，结果表明HNMhy1毒力较强。

HNMhy1株对保育猪具有良好的免疫原性。用猪肺炎支原体菌株HNMhy1制备的疫苗大剂量免疫无不良反应、安全，对强毒的攻击具有较好的保护效果。以上试验证明，HNMhy1株适合灭活疫苗的候选毒株。