云南独蒜兰研究进展

金贝诺，周芳美

（浙江中医药大学 医学技术学院，浙江 杭州 310000）

云南独蒜兰（Pleione yunnanensis Rolfe），兰科独蒜兰属的一类地生或半附生草本植物，被列为国家二级珍稀药用植物。又名滇独蒜兰、糯白及、独叶白及，多生长在贵州、云南、四川和西藏等地，常见于海拔1100～3500m处的荫湿地带[1-3]。其干燥假鳞茎名为山慈菇，常以复方入药，在医药领域发挥很大的作用。但目前云南独蒜兰资源急剧减少，以致面临枯竭。研究发现，人类对云南独蒜兰无限制的滥采滥挖是造成资源短缺的主要原因。本文主要从近年云南独蒜兰国内外的资源现状、繁殖方式等方面的研究进行综合概述。

1 云南独蒜兰资源现状

云南独蒜兰分布在中国四川、贵州、云南、西藏和缅甸北部。长期依赖其野生资源作为药用，随市场需求量突增，野生云南独蒜兰遭到毁灭性的挖掘，其野生资源储存量锐减，导致价格上扬。自2008年起，山慈菇的药材价格从30元/kg上涨到近年的260元/kg[4]，而云南独蒜兰的种苗则已卖价160元左右/kg，如今其已经被列为珍稀濒危植物。

云南独蒜兰对生长环境要求较高，喜四季分明的气候和通风、清凉的半阴环境，通常生长在疏松、透气的蕨根、水苔或腐殖土中，易受高温影响而迅速枯死。云南独蒜兰虽种植广泛，但因为其生存条件严苛，缺乏完整栽培体系、生产规模小，以及人类长期大量采挖，导致其资源濒临枯竭。随着云南独蒜兰研究的深入，其更多药理作用将被挖掘，市场需求量只会越来越高，进而加剧供需缺口。届时，云南独蒜兰可能成为珍稀的野生药材原料。 因此寻找一种高效、快速繁殖云南独蒜兰的技术是当务之急。

2 云南独蒜兰传统繁殖方法

云南独蒜兰的种子的有性繁殖是目前栽种培育云南独蒜兰的重要方法，其花期3～4月，果期4～11月，一个蒴果内通常含21000～34000颗种子[5]。云南独蒜兰繁殖一般采用自然繁殖法和分株法，生产上以分株法为主。一个假鳞茎每年只生长1～3个新球茎，老球茎待新球茎长成后，因养分耗尽而死亡，因此无性繁殖率极低。另外，云南独蒜兰的生长周期较长，若用传统的种子繁殖，需要4～5年才能开花，而子球也需2～3年的时间，因此种群数量在自然状态下增殖速度很慢。

2.1 自然繁殖

云南独蒜兰种子成熟时，胚发育尚未完全，其种皮胞质、细胞器退化，又缺乏胚乳供给营养成分，导致种子自然萌发的死亡率高[1，6]。经统计发现：在发育成原球茎时，种子死亡率高，主要以种胚变色、种胚消解的形式死亡。云南独蒜兰种子细小且无胚乳，天然状态下难以独立萌发成苗，即使发育成具备光合作用能力的幼苗，所需营养全部由共生菌根真菌提供，不能进行光合作用，但这类真菌对幼苗有一定的毒性，最终会引起老根腐烂。因此云南独蒜兰自然繁殖成功率低，难以高效繁殖。

2.2 分株法繁殖

当前云南独蒜兰繁殖以分株法为主。云南独蒜兰繁殖多以假鳞茎作为材料，经历假鳞茎诱导、壮苗及生根、增殖与继代、试管苗移栽五个过程[1]，成熟假鳞茎每年通过分株繁殖，大都可增殖3～4倍[7]。分株繁殖宜用休眠期的假鳞茎在秋后地上部分倒苗或者在早春栽种，分株的成熟假鳞茎上通常会有个别较小的假鳞茎，在栽培中开花的假鳞茎每次可产生2个能开花的假鳞茎[7]。此外，云南独蒜兰的分株繁殖还有许多问题亟待解决：根部脆弱，操作不当易损伤兰苗；根系交错，缠绕紧密，难以分离主干；根部依靠共生菌群获取养分，分株易造成益生菌群分离破坏，进而造成供氧不足，病害死亡；分株对环境条件要求严苛，温度和湿度影响非常之大。

3 现代繁殖方法

3.1 共生萌发

兰科种子数目庞大，进行种子的快速繁殖是一种切实有效的方法。通过共生萌发而发育的苗通常存活率较高。云南独蒜兰种子萌发初期，缺乏营养成分，真菌的入侵可以为种子供给营养成分和其他代谢产物，还可以保护种子不受外来细菌的感染。用于共生萌发的真菌需要经过耗时较长的筛选，但一经确定最适菌种后即可大批量生产。云南独蒜兰作为兰科植物，其种子十分微细，不具胚乳，自然生长条件下完全依靠特定的共生真菌提供营养，促进其萌发和形成幼苗[8]。因此曾有人提出了利用共生萌发原理来筛选出能促进云南独蒜兰种子萌发的菌株，以此来提高云南独蒜兰的萌发率和成活率。此方法理论可行但实际操作存在很多问题，云南独蒜兰的生长过程中往往同时和多种真菌共生，其菌根真菌区系构成又受到很多因素的影响，明确其中每种真菌的生态功能相对困难。而且部分分离得到的真菌对种子的促萌发作用只能持续到原球茎阶段而无法保证幼苗形成，种子在继续培养阶段便将停止生长。不仅如此，实验室条件下发现的萌发真菌应用到天然复杂环境中是否能不受环境影响而发挥作用依然无法确定[9]。

3.2 组织培养

云南独蒜兰利用非共生萌发进行组织培养，即在人工培养基上不另外添加真菌感染使云南独蒜兰种子萌发。其可以高效地获得大量幼株，因此也是目前经济、有效的快速繁殖方法之一。当前比较常用的培养基有MS、KC、N6和RE等。张燕等认为，在云南独蒜兰组织培养研究中[6]，可以通过外植体培育组培苗，其中以种子为外植体是最佳的方法。运用组织培养技术，可以解决云南独蒜兰传统繁殖迟缓、种胚发育不全、自然条件下种子难以独立发育成苗等问题，同时可以满足大量繁殖云南独蒜兰的需求，减少野生资源的采挖，保护野生资源[10]。但组培技术在实际操作问题尚存，要综合考虑影响实验因素筛选出最适合云南独蒜兰的培养基和激素浓度，而且操作手法不规范或消毒不彻底会导致污染[11]。吴丽芳等[12]以叶片或鳞茎为外植体进行再生繁殖，结果表明二者均有缺陷，用叶片组织培养不能获得大量的组培苗，而小鳞茎芽培养条件苛刻、培育时间过长且成功率低。李春华等[7]用无病壮实的新生的小鳞茎，接种于MS+1.0-3.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+3.0%浓度的蔗糖及0.55%的琼脂，经3个月，可产生原球茎。当增殖分化成丛生芽，可在1/2MS+3.0-5.0 mg·L-16-BA+0.2-0.5 mg·L-1NAA的培养基上，继续进行继代培养，3个月后才分化出0.5 cm大小完整的植株小苗。此外，云南独蒜兰的组织培养病菌感染率高，消毒剂效果差[1]，10%H2O2和2%NaClO组合使用污染率可达82%以上，以2%NaClO处理7 min，10%H2O2处理5 min时，污染率为93%。如何通过改进培养基配方、添加物以及培育方法来进一步提高萌法率，仍是需要进一步研究的课题。只有不断改进、完善组织培养技术手段，建立最优组织培养快速繁殖体系，才可满足云南独蒜兰大量的供给需求。

4 云南独蒜兰栽培技术

云南独蒜兰为喜光植物，适合透光率为15～40%，但阳光太强易产生日灼，夏季需适当遮光、避免暴晒；春冬季节气温较低，需用多孔的浅盆栽培。云南独蒜兰适合空气湿度为65～75%，因此浇水常采用喷浇。云南独蒜兰最适生长温度为17～21℃，冬季休眠期要求2～5℃，花期最盛期12～26℃。

云南独蒜兰根系浅，用多孔的浅盆栽培最佳，常用苔藓+腐殖土+沙壤为土壤搭配[12]。其培植基质要求稀松透气且能够保水保肥。盆栽材料可以用附生或半附生兰花的培植基质，如青苔、水草、松树皮、泥炭土和腐叶土等。盆栽时盆体下部2/3填充较粗大的颗粒，并在新生假鳞茎周围填充细小树皮块和苔藓。定植时，轻轻地将小苗移入带基质的营养钵中，深度应为不没及鳞茎的一半[13]。

5 云南独蒜兰化学成分研究

近年来，随着人们对云南独蒜兰的应用逐渐增多，国内外学者为了进一步开发利用云南独蒜兰植物资源，对其化学成分进行了深入研究。迄今为止，研究人员分离云南独蒜兰得到有菲类、联苄类、苷类、木脂素类、蒽醌类、黄酮类、甾体类等10种类型85个化学成分。王晓娟等[14]将云南独蒜兰的假鳞茎经95%乙醇提取，并用醋酸乙酯萃取，从其中分离并鉴定了5个二氢菲、4个联苄类化合物、2个三萜类化合物等14个化合物。Yang Wanga等[15]和PL Majumder等[16]通过层层化学对比，发现菲及二氢菲类和联苄类化合物这两类化合物具有抗肿瘤、细胞毒作用及脱粒作用等多种药理活性。云南独蒜兰的药用有效成分秋水仙碱及其衍生物秋水仙酰胺具有抑制多种动物移植性肿瘤的作用。Li Y等[17]从云南独蒜兰的正丁醇提取物中发现了一种新的化学物质——丁烯基黄酮；Li Y等[18]从云南独蒜兰假鳞茎中分离得到四种新的吡咯烷酮取代的联苄，并且发现这四种新物质是两对差向异构物。

6 云南独蒜兰药理作用

随着科技发展，人们对云南独蒜兰多方面药理作用进行深入研究，发现云南独蒜兰还具有抗肿瘤、影响造血功能、抗氧化、降脂、激活酪氨酸酶、降压等功能。

6.1 抗肿瘤作用

云南独蒜兰的干燥假鳞茎是中药山慈菇的主要来源。徐小娟等[19]通过建立动物模型，山慈菇多糖作用于小鼠H22实体瘤肝癌，检测血清中白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子（TNFα）的活性高于模型组，得出山慈菇多糖一定程度上能够抑制肿瘤细胞的增殖。叶丽芳等[20]研究不同浓度的山慈菇水提取物对胃癌细胞HGC-27的影响，通过MTT法检测抑制率，实验结果表明山慈菇水提取物对胃癌细胞HGC-27有体外抑制作用，且与其浓度和作用时间相关系，证明了山慈菇里的某些成分可以杀死肿瘤细胞。有学者认为，山慈菇抑制肿瘤生长是通过抑制新生血管发生的。鉴于此，李余先等[21]采用活性跟踪法检测山慈菇提取物对人脐静脉细胞株增殖的抑制率以及相应的IC50值。实验结果表明山慈菇提取物虽效果不及Retinoic acid，但可以抑制血管形成。Shao SY等[22]从云南独蒜兰的乙醇提取物中分离出了bulbocodioidins A-D，通过广泛的NMR分析，结合实验和计算得出的ECD（电子圆二色性）数据分析，确定了它们的结构，并在几种人类癌细胞系中评估了其细胞毒性作用，表现出明显的细胞活性，由此可得出云南独蒜兰有抗肿瘤作用。

6.2 影响造血功能

随着工业的发展，由于接触各种化学品、药物或射线等引起的继发性再生障碍性贫血症发现率逐年增高，临床上除了消除病因或杜绝继续接触这些因素外，采用中医药治疗已使此症的疗效大为改观。由云南独蒜兰的假鳞茎入药制成的山慈菇复方制剂具有养阴、清热解毒及健脾生血的效能，可显著降低环磷酰胺及甲苯对骨髓的毒性，还可以改善外周微循环、刺激骨髓造血细胞，使髓系细胞系增生，有利于损伤机体功能的恢复。

6.3 抗氧化作用

孟海波[23]分别给小鼠进行生理盐水和不同浓度的山慈菇多糖的连续灌胃，测定各组小鼠的血清、肝脏及肾脏中的GSH-PX、SOD、CAT、MDA和T-AOC等数值。结果显示，对比对照组，各实验组的小鼠血清、肝脏及肾脏中的GSH-PX、SOD、CAT活性和T-AOC都有提高；而小鼠血清、肝脏和肾脏中的MDA水平明显降低，表明了山慈菇多糖有显著的抗氧化作用。

6.4 降脂作用

孟海波[23]建立分别进行生理盐水和高、中、低剂量山慈菇多糖灌胃的小鼠模型，给空白对照组饲喂全价饲料，其它各组均饲喂高脂饲料。实验结果显示，与模型组相比，各实验组的小鼠血清中TG、TC和LDL-C浓度都有不程度的降低，HDL-C浓度也有不同程度的升高，证明了山慈菇多糖具有降脂作用，且达到一定剂量时才能有效降脂。

6.5 激活酪氨酸酶

酪氨酸酶是皮肤黑色素生物合成的关键酶，其活性降低可引起白癜风等色素障碍性皮肤病，其基因突变则可引起白化病。能激活酪氨酸酶或者能上调其活性的物质，在体外还能够促黑素细胞增殖、分化，均有可能应用于治疗色素障碍性皮肤病。经研究[24]表明，多种中药都能够激活酪氨酸酶，其中山慈菇的激活作用较好，可以达到治疗皮肤病的效果。

7 云南独蒜兰临床应用

《云南植物志》记载云南独蒜兰用于矽肺、肺结核、气管炎、热性哮喘、咳血、消化道出血、外伤出血、烫火伤、疖肿[25]。《新华本草纲要》记载云南独蒜兰具有清热解毒、消炎镇痛、化痰散结、痈肿疗毒的疗效。云南独蒜兰的假鳞茎通常入药，被称为山慈菇，其味苦、微辛、麻，性凉。山慈菇在临床上常用于抗肿瘤，且多以复方入药，效果良好。《中国药典》中还将云南独蒜兰与独蒜兰的干燥假鳞球茎二者合称为冰球子，且作药材性状和鉴别[26]。

8 展望

云南独蒜兰物种珍贵，是我国传统名贵中药，药理功效显著。目前我国云南独蒜兰资源短缺，产量难以满足市场需求，造成供不应求的市场现状，使云南独蒜兰价格抬高。不仅如此，云南独蒜兰种质大大降低，很大程度地限制了独蒜兰产业的开发和发展。因此，有效保护云南独蒜兰资源已刻不容缓。云南独蒜兰植物种子细小，天然状态下难以独立萌发成苗，因此有必要建立一种快速的现代云南独蒜兰繁殖技术，这对于解决云南独蒜兰资源问题具有十分重要的现实意义。

目前国内外对云南独蒜兰快速繁殖技术的研究较少，研究者多采用传统的分株法培育云南独蒜兰，此类方法未能有效解决云南独蒜兰资源紧缺的问题，还有使其因病毒累积而使品种退化的风险。人工种子技术成本低、体积小、机械化程度高，是目前药用植物快速繁殖的常用方法。此外，目前人们也缺乏对云南独蒜兰资源现状的深入探索。因此有必要广泛收集云南独蒜兰的种质资源，并不断改进云南独蒜兰快速繁殖技术。相信随着研究的深入，采用高效的现代繁殖技术，结合传统优良种植模式，将有效解决云南独蒜兰的资源短缺问题。