植物病原真菌效应蛋白研究进展

王梧嵋

（西藏大学 理学院，西藏自治区 拉萨 850000）

细菌、真菌、病毒等微生物都能引起植物病害，但真菌引起的病害最为普遍，造成的损失也最严重。大致来说，植物寄生真菌的数量多于其他所有寄生体的总和[1]。活体营养的寄生真菌往往高度专化，它们可以通过特异性的效应蛋白改变寄主的生理和防御状态，促进自身的存活与繁殖。这些效应蛋白依据被分泌和发挥作用的位点大致被分为两类：细胞间效应蛋白和细胞内效应蛋白。前者发挥胞壁降解酶和部分蛋白酶抑制剂的作用，后者可抑制细胞内免疫系统中的关键靶标或被识别而激发过敏性坏死反应。

Flor 等提出的“基因对基因假说”[2]：为了破坏由病原特征分子（Pathogen-Associated Molecular Patterns， PAMPs）启动的植物基础防御反应PTI（PAMP-Triggered Immunity），病原菌将分泌一类具有特异性的毒性效应蛋白（effectors）；而植物随之在进化过程中产生一类抗性基因（R gene），编码出抗性蛋白（R protein）并特异性地识别效应蛋白，此时效应蛋白发挥无毒性功能（Avirulence，Avr），将激发植物下游更为激烈的免疫反应ETI（Effector-Triggered Immunity）。植物和病原菌在长期协同进化过程中[3]，不断发生效应蛋白发挥毒性破坏植物防御反应和效应蛋白被特异性识别激发免疫反应的过程，形成“Z”字拉锯[4]。

1 真菌效应基因的结构

目前所知的真菌效应基因在结构上并没有太明显的统一特征。从大麦云纹病菌中克隆得到的NIP1 效应蛋白富含半胱氨酸残基，从尖孢镰刀菌中克隆得到的SIX1（Secreted In Xylem 1）效应蛋白也具有这一特征。番茄叶霉菌的效应基因Avr2、Avr4、Avr4E 和Avr9，稻瘟菌的效应基因AvrPita、Pwl，它们所编码的效应蛋白除富含半胱氨酸外都是小分子的分泌蛋白[5]。自亚麻锈菌中克隆得到第一个锈菌基因Avr567 以来，目前已有30 多个效应基因被获得。它们全为分泌蛋白，且富含半胱氨酸，都能在植物抗性基因识别下激发植物抗病反应。而一些真菌效应蛋白并不具有信号肽结构，表明可能存在其它未知的蛋白分泌途径[6]。

2 真菌效应蛋白的转运

免疫荧光标记显示，蚕豆锈菌侵染寄主叶片后，分泌的效应蛋白RTP1 将在吸器周围富集。亚麻锈菌无毒基因AvrM和AvrL567 在烟草细胞中过表达后，其编码的效应蛋白将通过烟草细胞内质网介导的分泌系统分泌到细胞外[7]。对真菌而言，其效应蛋白的转运，既不同于细菌借由多种分泌系统，也不同于卵菌借由膜上磷脂分子完成；由于效应蛋白的多样性，它们可能采用多种不同的转运机制进入植物寄主体内。

3 真菌效应蛋白作用机制

病原菌分泌的效应蛋白进入寄主细胞间隙或细胞内部后，通过不同的方式来破坏寄主植物的防御反应，这是已发现的效应蛋白的一般共性，而大部分效应蛋白具体的作用机制仍不清楚。

3.1 特异性结合抑制免疫反应的激发

番茄叶霉菌通过释放效应蛋白Ecp6，在寄主植物中生长的同时抑制由寄主细胞壁中的几丁质诱导的PTI 反应[8]。Ecp6 蛋白含有LysM 域，通过选择性地与几丁质寡糖结合，阻止后者被寄主表面受体识别，从而抑制PTI 的激发。神奇的是，稻瘟病菌的分泌蛋白Slp1 也含有LysM 域，它可以发挥与番茄叶霉菌中效应蛋白类似的功能。Slp1 蛋白通过竞争性地与自身细胞壁被降解所产生的几丁质寡糖结合，阻碍水稻中的几丁质激发子结合蛋白CEBiP 识别这些几丁质寡糖，从而抑制由几丁质诱导的下游免疫反应。

大豆疫霉菌效应蛋白PsAvh262 可以通过结合内质网免疫球蛋白BiPs 来抑制内质网应激触发的细胞程序性死亡，负调控植物对大豆疫霉的抗病反应[9]。大豆疫霉菌分泌的效应蛋白PsXEG1 毒性很强，在进化过程中大豆植株产生了一种葡聚糖酶抑制蛋白GmGIP1，其与PsXEG1 结合从而影响其毒力。但最近的研究发现，大豆疫霉菌开始分泌一种无酶活性的旁系同位素PsXEG1 样蛋白PsXLP1，它更紧密地结合GmGIP1 而有利于PsXEG1 的释放，以实现病原菌的侵染[10]。

3.2 作为寄主酶类抑制剂发挥作用

番茄叶霉菌效应蛋白Avr2 能特异性地结合并抑制寄主植物所分泌的Rcr3、Pip1、TDI-65 等胞外酶，从而减弱植株的PTI 抗病反应[11]。玉米的过氧化物酶POX12 可以控制植株活性氧的产生，激发并调控植株激烈的抗病反应；而玉米瘤黑粉菌所产生的效应蛋白Pep1 通过在胞外与该过氧化物酶结合并抑制其活性，破坏下游信号传导。

3.3 调节寄主的代谢、基因表达与转录

玉米瘤黑粉效应蛋白Cmu1 是一个分支酸变位酶，进入植物细胞后，Cmu1 蛋白可以促使莽草酸酯合成途径中的代谢路径由合成水杨酸转变成合成芳香族氨基酸，使得水杨酸含量降低。而水杨酸是植物防御反应中重要的植物激素成员之一，其含量直接影响植物的免疫反应；因此，Cmu1 可以通过调节寄主细胞内的代谢途径来抑制寄主的防御反应。

由大豆疫霉菌产生的效应蛋白PsAvh23，在转运进入寄主细胞质后，通过结合寄主的组蛋白乙酰转移酶HAT 复合物操纵植物的组蛋白乙酰化过程，进而重编程防御基因的表达以促进自身感染[12]。大麦白粉菌的效应蛋白Avra10 可以被大麦的抗性蛋白MLa10 特异性识别，而研究证明MLa10 定位于植物细胞质与细胞核内，这说明效应蛋白Avra10 可以作为转录因子直接进入寄主细胞核内发生互作，调节抗病基因MLa10 的表达[13]。大丽轮枝菌分泌的效应蛋白VdSCP 41进入植物细胞核后，将直接靶向植物的重要免疫调控因子CBP60g 和SARD1，干扰其转录活性从而抑制相关免疫基因的表达[14]。

4 植物真菌效应蛋白功能研究方法

4.1 生物信息学预测、图位克隆获得效应基因

在获得病原菌基因组序列的基础上，可以利用生物信息分析软件（如Blast，SignalP，TargetP，TMHMM，和big-PI Predictor 等）对该病原菌的效应蛋白进行预测。

在 稻 瘟 菌 所 得 的 效 应 基 因 中，Pwl1、Pwl2、AvrPiz-t、Avr-Pita 和Avr1-CO39 是通过图位克隆得到的，还有油菜茎基溃疡病菌基因组异染色质的效应基因Avr Lm1 也是经图位克隆获得的[15]。Yoshida 等将基因组信息与遗传学结合起来进行分析，找到了3 个新的稻瘟病菌无毒基因[16]。

4.2 异源表达分析效应蛋白功能

4.2.1 农杆菌介导的瞬时表达

农杆菌介导的瞬时表达，具有时耗短、表达高，且涉及的基因转移和表达将不会在实验外对环境造成污染危害的优点[17]。在目的基因与CaMV 35S 启动子的共表达下，利用农杆菌注射植物叶片，可以在单一叶片中快速、简便地同时高表达多个重组载体[18]，这可以用于效应蛋白毒性及功能的初步鉴定。Chen 等结合农杆菌注射本氏烟叶片的瞬时表达技术和水稻原生质体制备方法，对5 个诱导植物细胞坏死的新无毒性效应蛋白进行了鉴定[19]。

4.2.2 寄主植株中稳定表达方法

通过构建稳定转化的植株，可以实现植物中效应蛋白的稳定表达。虽然在这项工作中，前期制备稳转植株所需周期较长，但这些植株将有利于获得大量的功能性分析结果，并为后续研究提供独特、合理的方法[20]。

4.2.3 酵母系统异源表达方法

研究发现，效应蛋白诱导细胞死亡和抑制细胞死亡这样的“双重”性是种间保守的，且在酵母表达中保持一致，如在酵母中表达效应蛋白AvrPtoB，它能够抑制被诱发的程序性细胞死亡[21]。Cesari 等利用酵母双杂交技术研究稻瘟菌无毒效应蛋白AVR1-CO39 与水稻中RGA4、RGA5 基因的互作，证实了水稻中的这两个基因是特异性识别所必需的。单卫星课题组利用酵母双杂交技术及其后的共聚焦显微镜亚细胞定位，鉴定了辣椒疫霉菌效应蛋白Pc Avr3a12 与寄主的靶标脯氨酰顺反异构酶（PPIase）FKBP15-2 发生免疫性互作[22]。

4.3 结构生物学分析

通过分析效应蛋白AvrPtoB 的晶体结构，发现其C 端对植物的细胞程序性坏死的抑制作用不依赖于N 端，而对效应蛋白AvrPto 进行核磁共振结构分析发现，它可能和Pto 发生相互作用而不受蛋白酶限制。

5 结语

真菌效应蛋白的高度多样性和与其他蛋白的低相似性，使得对这一病原特征物的研究难度加大[23]。鉴于目前所面对的是大量候选的、未知的效应蛋白，这将是一项具有挑战性的巨大工程[24]。而另一方面，对真菌效应蛋白的研究将有望揭示病原真菌营养方式和植物与病原真菌共同进化的分子机制，这可能将给植物疾病控制带来创新[25]。目前，国际上公认的最经济有效的作物病害防控措施是种植抗病品种，而具有识别无毒性效应蛋白功能的植物抗性基因便是其中的重要成员。

基因组研究、生物信息学分析、蛋白质定位和更多技术的快速发展，将为探索真菌效应蛋白在植病互作中所发挥的作用提供强大助力。