卫矛属植物组织培养的研究进展

周茂嫦，王彩云，侯 俊，成忠均，王 永，张翔宇*

(1.毕节市中药研究所，贵州 毕节 551700; 2.大方县扶贫开发办公室， 贵州 毕节 551700)

卫矛属(Euonymus)植物为卫矛科(Celastraceae)卫矛亚科(Celastroideae)卫矛族(Euonymeae)，是卫矛族中的族式属[1]，全属约有850种，其品种繁多、资源丰富，是中药研发的重要资源，主要分布于亚热带及热带地区。我国作为主产区，涉及111种、10个变种、4个变型[2]，其中约有61种被用于我国民间医药，主要分布于四川、贵州、甘肃、福建等省以及长江流域、华北和东北地区。卫矛属常见有卫矛(Euonymusalatus)、胶东卫矛(E.kiautschovicus)、白杜(E.maackii)、肉花卫矛(E.carnosus)和冬青卫矛(E.japonicus)等，大部分为灌木或藤本状灌木，少部分为乔木[3]。国内外学者在科学研究与生产实践中仍不断发现和鉴定变种、变型或新种。顾哲明等[4]在四川金佛及云南旧城各发现1个新种，分别命名为金佛山卫矛(E.jinfoshanensis)和木果卫矛(E.xylocour)。任继文等[5-6]在甘肃文县及舟曲各发现1个新种，分别命名为文县卫矛(E.wensienensis)和狭叶卫矛(E.stenophyllus)。陈谦海[7]在贵州发现1个新种，命名为鳞果卫矛(E.furfuraceus)。

卫矛属植物观赏价值高，适应性强，对提高人居生态环境及净化空气方面有重要作用；其根皮可提取硬质橡胶，种子含油量高[8]，具有重要的经济价值；另还具有重要的药用价值，对肿瘤、病毒、肺心病、泌尿系统疾病及心绞痛等有一定功效[9-11]，常用于解毒、治疗风湿痹痛和跌打损伤等。因此，国内外学者对该属植物的组织培养开展了大量研究，并优化了部分常用树种的快繁技术体系。张丽杰等[12]以带芽茎段为外植体，经初代培养、增殖培养、生根诱导培养及炼苗移栽等建立了桃叶卫矛(E.bungeanus)的组织培养体系，并培养出再生植株。尚爱芹等[13]建立了爬行卫矛下胚轴的高频离体再生体系；张微等[14]以带腋芽茎段为外植体，建立了胶东卫矛的组织培养技术体系。桑新华等[15]研究了不同激素配比及浓度、不同外植体对胶东卫矛组织培养的影响。另外，也有学者研究了扶芳藤(E.fortune)[12-17]、雷公藤(Tripterygiumwilfordii)[18-22]、南蛇藤(Celastrusorbiculatus)[23]、美洲南蛇藤(Celastrusscandens)[24]、丝棉木(E.maackii)[25-26]及肉花卫矛[27]的组织培养和快繁技术。但目前大部分卫矛属植物的组织培养体系并不完善，且普遍存在种胚、叶片愈伤组织分化困难，褐化率高、易污染、生根难及炼苗成活率低等问题。鉴于此，为卫矛属植物的资源保护及开发利用提供依据，从其组织培养外植体、基本培养基、培养条件和植物生长调节剂的筛选，及组培苗的驯化移栽等方面对卫矛属植物组织培养相关研究进行综述，指出存在的问题，提出未来的研究方向。

1 卫矛属植物组织培养的影响因素

1.1 外植体

1.1.1 外植体的选择 选择合适的外植体是组织培养成功的前提。虽然植物的很多部位都可作为组织培养的外植体，但不同的外植体再生能力不同。卫矛组织培养通常使用叶片、带腋芽茎段及种胚为外植体，根据外植体及培养途径可划分为愈伤组织诱导、茎段培养及胚培养等。

刘非燕等[27]利用肉花卫矛的带顶芽茎段、子叶和根段为外植体，成功诱导出完整植株；祖庆学等[28]以火焰卫矛(E.alatusCompacta)成熟胚培养长出的子叶为外植体，建立了一套完整的离体再生体系；尚爱芹等[29]研究发现，以爬行玉矛(E.fortuneivarRadicans)无菌苗下胚轴为外植体，芽原基可以直接产生于子叶下胚轴的表皮细胞，无需通过愈伤组织诱导分化即可直接形成不定芽。桑新华等[15]研究发现，胶东卫矛的茎段比叶片更容易诱导出愈伤组织，并且容易分化成苗。CHEN等[30]试验发现，10 d的鬼箭羽芽苗60%的子叶和70%的下胚轴在WPM+5.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培养基上可诱导出2～4个芽。研究表明，通过不同培养途径均能获得再生植株，以带腋芽茎段及种胚为外植体更容易诱导形成再生植株，且再生率高，而以叶片为外植体诱导愈伤组织，较难分化出不定芽。

1.1.2 取材时间 在植物组织培养中，不同取材时间的相同外植体灭菌效果及诱导率均不同。吴琰等[31]研究宽瓣卫矛、圆瓣卫矛和胶东卫矛不同时间段外植体的培养情况发现，3—4月宽瓣扶芳藤腋芽萌发时取材消毒，污染率最低，萌芽所需时间最短，萌发率最高，培养效果最好。周魏等[32]研究发现，双歧卫矛宜选4月下旬较嫩的带芽茎段为外植体材料。张家勋等[33]研究发现，种子的发育情况与接种时间有关，9月10日、9月30日接种时，种胚发育完整。为最佳接种时间。王晓花等[34]研究表明，卫矛种子采种时间晚可提高种子萌发率；刘继生等[35]研究发现，延长桃叶卫矛种子采收时间有利于提高萌发率。

1.1.3 外植体的消毒 外植体采集后需要进行消毒处理。目前，常用的消毒剂有酒精、0.1%升汞、抗生素及次氯酸钠(2%～5%)等，且联合使用消毒剂更有利于降低污染率，常用消毒组合为75%酒精+次氯酸钠或75%酒精+0.1%升汞。由于升汞等消毒剂对植物材料有毒害，在消毒过程中易残留，因此，应注意把握用量并妥善处理。祖庆学等[28]研究发现，火焰卫矛成熟种子消毒5 min，种胚严重染菌；消毒10 min和12 min，未发现种胚污染，但处理14 d后，消毒12 min的种子部分种胚死亡，无法诱导胚状体，而消毒10 min的种子14 d后诱导生长出具有绿色子叶及下胚轴的完整胚状体。桑新华等[15]研究发现，胶东卫矛带腋芽茎段用5% 次氯酸钠消毒，3 d后茎段开始污染，而用10%和15%次氯酸钠消毒的茎段未发现污染，综合考虑成本及次氯酸钠对外植体的杀伤作用，建议选用10%的次氯酸钠溶液进行消毒。余慧等[36]研究表明，次氯酸钠和酒精结合使用消毒效果优于使用单一消毒剂；先使用75%酒精消毒30 s，再用3%次氯酸钠消毒3～21 min，外植体诱导率呈先升后降趋势，18 min时诱导率最大。赵丽蒙[37]研究发现，氯化汞与吐温-20结合使用可大幅降低污染率。综上所述，卫矛属植物外植体消毒一般选用次氯酸钠、75%乙醇和氯化汞等消毒剂，且大多先用75%酒精消毒20～90 s，然后再用0.1%～0.15%氯化汞或2%～15%次氯酸钠溶液进行较长时间消毒。另外，由于同一物种不同的外植体或不同物种的外植体所需消毒试剂及其浓度、消毒时间均不同，因此，应根据外植体材料的种类、洁净程度、生长环境及生长期等选择适宜的消毒试剂进行不同时间和浓度的消毒处理，这是卫矛属植物离体快繁技术体系建立的关键。

1.2 基本培养基

组织培养技术体系建立的基础是适宜的培养基，其中的无机盐种类及浓度是关键因子。筛选适宜不同卫矛属植物的基本培养基一直是卫矛组织培养体系建立的一项核心内容。李军正[38]研究发现，MS培养基更适宜库普曼卫矛愈伤组织的萌发，采用MS培养基诱导愈伤组织其诱导时间最短且质地紧密、长势良好，各项指标均优于1/2MS和WPM培养基。祖庆学等[28]研究表明，WPM和MS培养基培养的愈伤组织接种14 d内长势无差异；30 d后愈伤组织增殖速度和生长状况出现差距，WPM培养基的愈伤组织增殖速度较慢，质地致密、绿色，而MS培养基的愈伤组织质地疏松、淡绿色，增殖速度较快；培养50 d后，MS培养基培养的愈伤组织有少量不定芽分化，而WPM培养基培养的愈伤组织分化率高，且有子叶直接分化出芽，暗示WPM培养基更有利于火焰卫矛愈伤组织诱导及芽分化。赵丽蒙[37]研究表明，基本培养基会影响不定芽增殖，其效果依次为White

1.3 休眠处理

由于卫矛种子的特殊性，在利用卫矛种子为外植体开展组织培养工作时，需进行前处理。研究发现，沙藏、层积、胚乳远端切除等方式均有助于卫矛种子打破休眠，提高发芽率。赵丽蒙[37]研究发现，未去除假种皮的卫矛种子萌发率为0，去除假种皮的沙藏种子在MS+2.0 mg/L GA3培养基中的萌发率最高。有研究证明，库普曼卫矛和桃叶卫矛的种子假种皮中存在某种能够抑制种子萌发的物质，其假种皮存在时，种子萌发率均为0[35，38]，可见假种皮是影响种子萌发的重要因素，而沙藏能够起到催芽作用，打破种子休眠。龙建华等[39]研究发现，沙藏处理后清水浸泡24 h的疏花卫矛(E.laxiflorus)种子出土时间最早、出苗率最高，平均出苗率为56%。王晓花等[34]研究证实，经隔年埋藏层积处理后，种子的萌发率高达96%。刘继生等[35]研究提出，低温层积可以打破种子休眠。陈钧林[40]研究发现，肉花卫矛种子休眠的主要原因是其种皮透气性差使种子的呼吸作用受到抑制，而采用层积变温处理可明显增加种子透气性，提高种子发芽率。张家勋等[33]研究发现，陕西卫矛(E.schensianus)种子远端切除1/4～1/3体积胚乳有利于萌发及出苗。可能原因：一是打破了坚硬种皮的包裹，二是胚乳是储存养分的“源”，其受到损伤刺激时，储存的养分会向子叶“库”流动，从而促进各器官的生长发育。

1.4 植物生长调节剂

植物生长调节剂及附加物是影响组织培养的主要因素之一，不同植物生长调节剂对卫矛组织培养的影响差异很大。

1.4.1 种子萌发及种胚诱导途径 卫矛组织培养过程中，种子萌发及种胚诱导受多种激素的影响。赵丽蒙[37]研究发现，GA3浓度为2.0 mg/L时，最适宜种子萌发；在种胚诱导进程中，单独添加NAA有利于诱导根毛生长，添加1 mg/L 6-BA时不定芽的诱导率有提升。张家勋等[33]研究发现，陕西卫矛种子在MS+1.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA培养基中生长情况最好。THAMMINA等[41]研究发现，卫矛植株的三倍体胚乳组织在培养基MS+2.2 μM BA+2.7 μM NAA中先暗培养8周再光培养4周，能成功诱导出绿色愈伤组织；之后在MS+4.4 μM BA+0.5 μM IBA培养基上培养8周后诱导出不定芽，最终成功诱导出三倍体无籽再生植株。张丽杰等[12]研究发现，1/2MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂为成熟胚萌发的最适培养基。BIAHOUA等[42]研究提出，不同类型、浓度的糖及培养基渗透压均可影响欧洲卫矛(E.europaea)体细胞胚胎的诱导，表现为葡萄糖浓度升高时体细胞诱导率降低，而蔗糖浓度升高时体细胞诱导率增大；当添加350 mM蔗糖或89 mM葡萄糖时，体细胞胚诱导量最大。

1.4.2 愈伤组织诱导及分化 卫矛属植物外植体可通过愈伤组织脱分化、再分化等器官间接发生途径再生形成完整植株。在卫矛属植物愈伤组织的诱导与分化过程中，添加适宜的6-BA、NAA、2，4-D、KT等生长调节剂可提高诱导和分化效率。余慧等[36]研究发现，6-BA对欧洲卫矛叶片愈伤组织的诱导效果优于TDZ(噻苯隆)，愈伤组织质量更优。袁云香[43]以陕西卫矛叶片和茎段为外植体，探讨影响陕西卫矛愈伤组织诱导的因素发现，不同浓度的激素处理同一外植体其生长情况不同，不同外植体的愈伤组织诱导情况也存在差异。祖庆学等[28]研究发现，火焰卫矛愈伤组织在WPM+6 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA培养基上生长良好，质地致密，颜色深绿，诱导率较高且有利于芽的分化。桑新华等[15]研究发现，添加2，4-D和KT的培养基上诱导愈伤组织无法分化成苗；而添加IBA和6-BA的培养基上诱导愈伤组织质地较为紧密，多呈块状，表面粗糙，颜色深绿或浅绿，不用更换培养基便可直接分化出丛生芽及不定芽。胡丽娟[44]试验表明，MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA为愈伤组织诱导的最佳培养基，诱导率高达95%以上；MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA为愈伤组织增殖的最佳培养基，愈伤组织重量可达2.269 5 g；MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA为愈伤组织分化芽的最佳培养基，分化率为95.26%。袁云香[43]研究发现，再分化培养基中添加3 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+5 mmol/L Ca2+，陕西卫矛愈伤组织再分化率明显提高。

1.4.3 幼嫩茎段诱导 目前，茎尖培养技术在陕西卫矛、双岐卫矛等多个卫矛属植物上利用已获得成功。赵丽蒙[37]研究发现，MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+7.0 g/L琼脂的培养基上卫矛茎段不定芽的诱导率最高，为70.67%；通过极差分析得出MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L培养基上不定芽的增殖效果最高，增殖系数高达23.51。胡丽娟[44]将陕西卫矛的幼嫩茎段接种到MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培养基上，光照培养8 d左右，腋芽开始萌动并逐渐伸长；25 d左右，腋芽伸长至2～3 cm，同时茎段基部开始膨大，形成黄绿色的愈伤组织。

1.4.4 不定芽诱导 卫矛属植物组织培养中，常添加NAA、IBA等生长素和6-BA、KT等细胞分裂素诱导不定芽。赵丽蒙[37]研究表明，1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA为不定芽增殖的最佳激素配比。桑新华等[15]建立胶东卫矛再生体系发现，生长素与细胞分裂素配比为1∶10时，茎段可诱导出愈伤组织并分化成不定芽。祖庆学等[28]研究发现，在WPM+6 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA培养基中火焰卫矛的愈伤组织能分化出大量生长旺盛的不定芽，且诱导效果最好，诱导率高达68.8%。另外，茎段和种胚均在6-BA与NAA浓度配比较高时表现诱导率增加，不定芽数增多，表明高浓度细胞分裂素+低浓度生长素有利于不定芽的形成[45]。

1.4.5 生根培养 以1/2MS为基础培养基，辅以一定浓度的IBA、IAA及NAA，较有利于卫矛属植物生根培养。袁云香[46]研究发现，在添加高浓度NAA及AgNO3的培养基组合中，平均根数较多、根长较长；其中，1/2MS+3.0 mg/L NAA+0.05 mg/L AgNO3培养基最有利于陕西卫矛生根，生根率达86.27%，且平均生根数、平均根长显著优于其余处理。但赵丽蒙[37]研究发现，添加GA3对卫矛生根有显著效果，当浓度为0.4 mg/L时，生根率最高，为72.5%；添加量为0.2 mg/L时，平均生根数最多，为5.1条。

1.5 炼苗与移栽

组培苗移栽成活率与栽培基质息息相关。为提高卫矛属植物组培苗的移栽成活率，炼苗移栽时通常选用草木灰、腐殖土、蛭石和河沙等通气性及保水性较强的栽培基质。周魏等[32]研究发现，双岐卫矛组培苗移栽到灭菌后的细沙+蛭石+珍珠岩(1∶1∶1)基质中，适当遮阴、保湿，移栽成活率达75%。张丽杰等[12]研究提出，移栽前进行2～3 d的炼苗，使小苗逐渐适应外界环境，然后将已生根的无菌苗移栽到盛有细沙+草炭土(1∶2)的容器中，10 d后小苗生长健壮，成活率高达100%。刘非燕等[27]研究发现，肉花卫矛无菌苗在无菌蛭石+珍珠岩(1∶1)的基质中，成活率达91%。李春玲等[47]研究提出，草炭+蛭石+珍珠岩(5∶3∶2)为丝绵木最佳生根基质，移栽成活率为85.48%，生根率为95.6%。赵丽蒙[37]研究发现，蛭石+2 500 mg/L IAA为卫矛试管外生根的最佳条件，平均根数为5.3条，生根率达100%；由正交试验极差分析得出生根剂、浓度和基质对卫矛生根的影响依次为浓度<生根剂<基质。炼苗基质中蛭石培养效果最好，草木灰效果最差。

2 存在的问题

2.1 污染

污染是植物组织培养过程中普遍存在且很难避免的问题，主要由细菌和真菌造成，细菌污染表现为培养基表面外植体周围出现油污状、水污状气泡或乳白、红色等菌落，通常具有臭味，一般接种1～3 d后即可发现；而真菌污染表现为污染位置长有各种颜色的霉菌，通常接种3～15 d后才会被发现，因此外植体生长是否正常需要15 d左右才能判断[48]。另外，按照污染源可分为内源性污染和外源性污染。通常外源性污染可通过严格控制环境条件、小心操作进行控制；内源性污染主要从外植体材料消毒、添加抗生素等方面控制，是最难控制的污染源[49]。春季阳光充足，降雨量少，不利于微生物生长，此时取材消毒效果较好；夏秋季节空气湿度大，温度高，最有利于微生物滋生，消毒难度增大。在自然状态下外植体材料表面附着的微生物随着暴露时间的延长逐渐增多，染菌率增高[38，50]。为降低卫矛组织培养过程中的污染率，一般于晴天采集外植体，并优先选用生长旺盛且污染较少的部位，如幼胚芽、未成熟的合子胚等。BARRERA-GUERRA等[51]研究发现，添加一定浓度的庆大霉素、利福平或四环素等抗生素可降低外植体污染率。虽然抗生素有一定的抑菌效果，但容易分解、失活，且并不适用于所有菌种，使用浓度不当还会影响外植体生长。

2.2 外植体褐化率高

卫矛属植物体内含有丰富的醌类、酚类成分，其在组织培养过程中不断积累扩散，损伤外植体，严重影响快繁体系的建立。外植体的取材时间、取材部位、所用消毒剂、生理状态、培养条件及受伤程度等对褐化有影响[52]。因此，可通过选用适宜的培养基、适宜的外植体、添加活性炭等防褐化剂、连续转移外植体及预处理试验材料等方式减少褐化。祖庆学等[28]研究发现，在培养基中添加0.5～1.0 g/L活性炭，不仅能缩短火焰卫矛组织培养的继代时间，而且还能显著降低褐化率。ENCINA等[53]研究发现，添加活性炭能降低外植体的褐化率。虽然添加活性炭可在一定程度上抑制褐化，但需控制用量，否则会对外植体产生负面影响。另外，防褐化剂虽然可在一定程度上降低褐化率，但对部分褐化现象较严重的植物效果不显著。所以，需要从分子及生理机理方面深入探讨褐化机制，以从根本上解决褐化问题。

2.3 组培苗生根难

诱导组培苗生根是植物组织培养中一个极其复杂的生理生化过程，影响培养材料生根的因素主要有取材部位、外植体基因型、培养条件、植物生长调节剂及培养基类型等。卫矛生根培养是其快繁体系的关键环节，但卫矛组培苗生根难度大，主要体现为一些品种生根率低，难以获得完整植株[37]，如欧洲卫矛、鬼箭羽等。因此，如何获得有优良根系的卫矛组培苗是其组织培养急需解决的一大难题。

2.4 组培苗移栽成活率低

卫矛属植物组培苗移栽成活率较低，其原因一是组培苗根系较脆弱，移栽时易折断；二是组培苗移栽后易感病而死亡。因此，在建立卫矛属植物组织培养快繁技术体系时需提高组培苗适应环境的能力以及不定根质量，以提高移栽成活率，为卫矛产业的规模化发展奠定基础。

3 展望

卫矛属植物药用价值、经济价值以及观赏价值较高，在入药、园林绿化中得到广泛应用。随着卫矛属植物组织培养技术体系的建立及优化，胶东卫矛、陕西卫矛等部分卫矛属植物已经能够规模化育苗，但内生菌污染及褐化问题普遍存在，且处理成本较高、方式较繁琐，不利于商业化发展，因此还需进一步探索更加简便、低廉的解决方法。

就卫矛组织培养技术而言，其胚乳培养与叶片等外植体诱导存在分化困难、成苗率低等问题，再生植株技术仍不够成熟。因此，今后还需要加强叶片、胚乳诱导培养方面的研究。另外，虽然有关卫矛属植物组织培养的研究已有大量报道，但集中于冬青卫矛、胶东卫矛和火焰卫矛等，鬼箭羽、栓翅卫矛等许多药用价值、经济价值很高的品种却未见报道，该属植物组织培养研究还具有巨大的发展空间。因此，有关卫矛属不同种植物组织培养技术的研究还需加强。此外，可以将生理生化、基因工程、分子生物学等方面的研究与组织培养技术相融合，以促进卫矛资源的保护及开发利用。