粮食作物中主要真菌毒素及其检测方法的研究进展

王 星， 杨新文*， 费 晨， 王 印

(1.安徽中储粮粮油质监中心， 安徽 合肥 230000； 2.山东中储粮粮油质监中心有限公司， 山东 济南 250100)

粮食作物是人类赖以生存的基础物质，容易受到真菌毒素的污染。真菌毒素是真菌在生长过程中形成的一类对人和动物具有毒害作用的次级代谢产物[1]，目前已知真菌毒素及其类似物有400余种，其中3/4已被证实对人类健康有影响[2]。据统计，全世界每年约有2%的农作物因污染严重而失去经济和营养价值，造成极大的经济损失和资源浪费，同时给人和动物食物安全带来极大威胁，甚至会产生细胞毒性、免疫毒性及“三致”等毒副作用[3]。研究发现，人类和动物即使摄入微量的真菌毒素及其代谢物也会产生富集作用，危害健康。粮食作物中因多种产毒菌污染产生的协同毒性远大于单种或多种毒素相加的作用[4]。因此，建立有效的真菌毒素污染监控至关重要，世界各国正逐渐强化对毒素污染的管理和防治，目前已有100余个国家和地区出台食品中真菌毒素限量规定，极大地推动了真菌毒素检测方法的发展和相关法规的规范。近年来，国内外研究者对真菌毒素进行了大量研究，为进一步深入研究真菌毒素的种类及其检测技术，有效防控粮食作物的真菌毒素污染提供参考，从目前粮食作物中已发现的黄曲霉毒素、赭曲霉毒素及脱氧雪腐镰刀菌烯醇等主要真菌毒素种类及其检出限，以及真菌毒素检测方法2方面对相关研究进展进行综述。

1粮食作物中主要真菌毒素及其检出限

1.1黄曲霉毒素

黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是一种由黄曲霉和寄生曲霉等代谢形成的有严重毒性的物质，已发现的衍生物多达20余种，常见的有AFB1和AFB2等，其中，AFB1的毒性最强，其毒性约是氰化钾、砒霜等剧毒物质的几十倍。AFB1可导致人和动物的急、慢性中毒，对肝脏、肺和肾脏等多种组织器官造成不可逆的损害，黄曲霉毒素是目前已知最强致癌物，具有很强的“三致”作用[1]，被世界卫生组织(WHO)列为I类致癌物。黄曲霉毒素性质稳定，在强酸及高温等常见脱毒条件下难以完全分解。AFB1广泛存在于玉米、花生等日常食用的粮油作物中，HACBEKIROGDU等[5]对采集的62种样品进行黄曲霉毒素污染的检测发现，毒素超标的样品在75%以上，其中栗子等食品的毒素含量最大。目前，我国仅对部分食品中的AFB1和AFM1作限量规定[6]：小麦、大麦、小麦粉、麦片和其他谷物，豆类及其制品、其他熟制坚果及籽类中AFB1的最高允许限量≤5.0 μg/kg；稻谷、糙米和大米中AFB1≤10.0 μg/kg；玉米、玉米面(渣、片)及玉米制品，花生及其制品、花生油和玉米油中AFB1≤20.0 μg/kg；婴幼儿配方食品中AFB1≤0.5 μg/kg；乳、乳制品和 (较大)婴儿配方食品中AFM1≤0.5 μg/kg。对AFT总量等的限量标准仍需进一步探讨。

1.2脱氧雪腐镰刀菌烯醇

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)又名呕吐毒素，是禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等产生的次级代谢产物，属单端孢霉烯族化合物，具有强烈的毒性，可使人和动物产生恶心、嗜睡或呕吐等急性中毒症状；若长期食用被DON污染的物质将造成细胞免疫反应功能障碍[7]、皮肤炎症[8]、溶血性疾病及神经系统紊乱等损伤。DON对粮食污染的广泛性是世界性问题，常见于小麦和玉米等农作物生长、储运过程中。基于DON的严重危害性，世界各国或组织都对食品中DON的允许限量作出明确规定：中国规定小麦、玉米及制品中DON的最高允许限量≤1 000 μg/kg[6]；美国规定未清洗软质小麦中DON≤2 000 μg/kg，食用小麦最终产品中DON≤1 000 μg/kg，饲料用小麦及其制品中DON≤4 000 μg/kg；欧盟规定小麦和燕麦中DON≤1 750 μg/kg，谷粉和玉米粉中DON≤750 μg/kg。

1.3玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮(ZEN)是由多种镰刀菌产生的一种难溶于水，易溶于甲醇的非甾体雌激素样作用的真菌毒素，亦称F2毒素，其在霉变的玉米和高粱等谷类作物中广泛存在，是污染范围最广的镰刀菌毒素之一。因其毒性较强，在饲料和食品的加工过程中不易被破坏；能够产生生殖毒性和细胞免疫毒性等，严重威胁人和动物的生命健康。各国或组织都对ZEN的限量标准作出具体规定：中国规定玉米类饲料中ZEN最高允许限量≤500 μg/kg，谷物(小麦、玉米)及其制品中ZEN≤60 μg/kg[6]；欧盟于2007年规定玉米和谷物中ZEN的最高允许限量分别≤350 μg/kg和≤100 μg/kg；澳大利亚规定黑麦中ZEN≤60 μg/kg。

1.4赭曲霉毒素

赭曲霉毒素(Ochratoxins，OT)是主要由赭曲霉、硫色曲霉等多种曲霉菌和鲜绿青霉产生的有毒次级代谢产物。赭曲霉毒素有 A、B、C和D 4种异构体，其中赭曲霉毒素A(OTA)在自然界中分布最广泛[9]，毒副作用最强，人和动物食用含有OTA的食物易产生神经、免疫毒性等危害[10]。OT不仅能引起不可逆性的肾功能衰竭(大鼠经口LD50为20 mg/kg)[11]，还对肝脏、肾脏及泌尿系统具有“三致”作用，国际癌症研究机构(IRAC)及世界卫生组织(WHO)将其列入2B类致癌物。目前，已有多个国家对OTA的限量作出规定：我国规定谷物、豆类及其制品中OTA的含量≤5 μg/kg[6]，瑞士规定谷物及其制品中OTA的含量≤2 μg/kg，巴西规定小麦、玉米、豆类OTA的含量≤50 μg/kg等。丹麦和法国规定谷物中OTA的含量≤5 μg/kg。

1.5伏马毒素

伏马毒素(fumonisin，FUM)主要是由串珠镰刀菌和轮状镰刀菌产生的一类双酯化合物的次级代谢产物，耐热，遇酸后水解产物仍有部分毒性。伏马毒素可对人和动物的神经系统、肺部和免疫系统造成极大损伤，并有较强的致癌性，致癌机理主要是髓鞘样碱基的异常堆积，破坏DNA的正常合成[12]，国际癌症研究机构(IRAC)将其归为2B类致癌物。FUM广泛分布在玉米、水稻等农作物中，目前已知的FUM衍生物有FA1和FB1等11种，其中FB1含量最高，毒性最强。美国规定玉米及其谷物制品中FUM最高允许限量≤1 000 μg/kg，婴幼儿玉米制品谷物中FUM≤200 μg/kg；法国规定谷物中FUM≤1 000 μg/kg；我国尚未对FUM作出限量规定。有监测表明，我国部分地区的玉米、水稻中的FUM检出率为28%～100%，最高含量达15.2 mg/kg[13]。

2真菌毒素的检测

2.1定性检测方法

2.1.1电子鼻分析法通过模拟动物嗅觉器官实现对气味的有效识别及组分判断，是一种比较前沿的定性分析方法。当前，通过此方法已能完成玉米和稻谷等粮油作物中赭曲霉毒素和呕吐毒素等真菌毒素的特异性鉴别检测，识别率≥80%，且此技术仍在不断地研究优化，预计将来可在粮油真菌毒素监测中得到广泛应用[14]。

2.1.2生物鉴定法通过在生物体上试验判定真菌产生的危害，并对其毒性部位和毒性机理进行验证，是一种比较传统和直观的定性分析法。常见的生物鉴定法有种子发芽试验、皮肤毒性试验和组织细胞培养试验等，其具有对样本纯度要求较低的优点，但也存在精准度低、易污染，特异性、重复性及灵敏度不佳等缺点。故此法仅用作化学法等其他分析方法的辅助方法[15]。

2.1.3质谱成像分析法质谱成像技术(MSI)是一种简单、高效的定性方法，其通过质谱离子扫描与成像技术结合测定，再对得到的目标物质荷比(m/z)信息进行分析、归类[16]。SEBASTAIN等[17]采用基质辅助激光解吸-飞行时间质谱成像技术同时检测鉴别被污染葡萄中的OTA及12种伏马毒素，直观地看到其污染程度和污染区域。BERISHA等[18]研究指出，采用激光解吸-高分辨质谱成像技术快速筛查鉴定小麦种子中的DON，样品无需前处理，结果误差<2×10-6μg/kg，且不受水分含量影响。MSI检测步骤简单、效率高，且可同时测定多种毒素污染的程度和分布，但由于进一步的确证和定量仍需借助其他检测技术。因此，MSI在食品安全检测中的应用尚不广泛。

2.2定量检测方法

2.2.1理化检测法

1) 薄层色谱法(TLC法)。TLC法是一种最早被广泛用于真菌毒素检测的经典的化学分析方法，主要通过特征性的显色反应和色谱保留规律，对样品进行分离、定性和定量分析，该方法操作简便快速，难度低，损耗低。AOAC首次提出用薄层色谱检测法测定花生中的黄曲霉毒素[19]，后被多个国家认可并采纳为标准方法。该方法在2009年以前曾长期作为我国真菌毒素检测国标第一法。TEIXEIRA等[20]使用TLC法和电荷耦合检测器(CCD)对88份红酒样品中的OTA污染情况进行筛查发现，其污染率为5.7%，该方法的定量限和检测限分别为0.8 μg/L和0.2 μg/L，平均回收率为82.3%。TLC法虽可操作性高，但存在过程复杂、精密度差、结果易受主观影响和无法实现自动化等缺点，目前已经难以适应当下日常检测的需要。在一些实验条件有限的情况下，TLC法在监测和分析研究等方面仍具有一定的优越性。快速的定性筛选判断仍多采用此法。

2) 高效液相色谱法(HPLC法)。HPLC法是现代科学领域中重要的分离、分析技术，是以液体作为流动相，用颗粒极细的高效固定相进行成分分离的柱色谱技术。真菌毒素检测广泛地采用HPLC法，其检测分离效能高，可同时检测多种真菌毒素。HPLC法常与稳定快速的样品前处理方法、衍生方法结合使用，免疫亲和柱净化法(IAC)是最有效的前处理方法，其原理是用抗原-抗体的免疫反应作为依据，利用单克隆抗体与目标真菌毒素的特异性吸附进行分离净化。于彦彬等[21]将花生样品通过固相萃取净化后，采用柱后衍生-高效液相色谱法测定其中的4种黄曲霉毒素，回收率为68.8%～101%，RSD为5.0%～7.1%。谢刚等[22]通过研究自动化免疫亲和在线净化-HPLC法，实现样品净化和检测同步化，且支持高通量样品检测，有效提高了样品检测的效率。由于HPLC法前处理过程复杂、经济成本高，因此其虽灵敏度高，结果精确，但无法满足大批量样品的快速筛查。

3) 液相色谱-质谱法(LC-MS/MS法)。LC-MS/MS法兼具色谱法的高效分离和质谱检测器的通用性，对真菌毒素检测适用性广、灵敏度高，可同时完成对多种毒素的检测。MEERPOEL等[23]采用UPLC-MS法同时对食品、饲料中的OTA和柑桔素进行检测，定量限分别为5.6 μg/kg和3.9 μg/kg，该方法的相关指标满足欧盟No.401/2006/EC和No.2002/657/EC指令要求。STEFANOVIC等[24]对比ELISA法和高效液相色谱-质谱检测技术(UPLC-MS)测定牛奶(n=250)中AFM1及玉米(n=100)中AFB1，回归分析结果显示，AFB1样品之间的一致性(R2=0.994)高于AFM1样品之间的一致性(R2=0.920)，进一步验证了2种方法的适用性和可靠性。近年来，为了适应检测需要，提高分析效率，常将实时直接分析技术(DART)与UPLC-MS法融合应用于食品真菌毒素的分析检测。宫小明等[25]应用QuEChERS技术对红酒样品进行前处理后，直接进样分析表明，在1.0 μg/kg、2.0 μg/kg和10 μg/kg 3个加标水平下，回收率为88.7%～105.7%，RSD为8.5%～12.8%，定量限为0.5 μg/kg。既方便省时，又减少溶剂污染，比较适合进行大批量的样品检测处理。

4) 气相色谱检测法(GC法)。GC法是利用惰性气体将气化的样品带入色谱柱中进行分离检测，常用于具有良好气化性能、弱荧光或弱吸收的真菌毒素检测，具有分离效能高、方法灵敏度高、分析速度快和选择性强等优点。YUE等[26]使用GC法分析中草药及相关产品中的呕吐毒素含量，检出限为2 μg/kg，加标试验回收率为85.5%～97.2%，RSD<6.3%，与GC-MS的测定结果一致，验证了2种方法的适用性和可靠性。此外，GC法也是展青毒素、玉米赤霉烯酮和链格孢毒素的常用检测方法[27]。

5) 气相色谱-质谱法(GC-MS法)。GC-MS法利用物料在色谱柱中吸附性能的差异、极性及沸点不同进行分离和鉴定混合物，该法优点是抗干扰能力极强、高灵敏度、误差小、回收率高且可同时检测多种真菌毒素。TANG等[28]采用GC-MS技术测定谷物中DON含量，只需真空干燥和衍生化2步简单前处理即可进样分析，该法分析时间<15 min，对3-keto-DON、3-epi-DON和DON的检测回收率为89.5%～103.6%，检出限分别为5×10-11mg/L、3×10-9mg/L和8×10-10mg/L。但GC-MS法不适于链格孢霉毒素等稳定性强、难挥发的真菌毒素测定。

6) 超临界流体色谱法(SFC法)。SFC法利用改变超临界流体溶剂的温度和压力控制超临界流体中不同组分的溶解度，从而达到分离、检测待测物的目的。该法具有对环境友好和高效等特点，且在真菌毒素检测过程中，能够对不同真菌毒素异构体实现分离。MARTHE等[29]首次提出采用超高效-超临界流体色谱串联质谱的方法检测啤酒中游离菌毒素和修饰菌毒素，成功测出啤酒样品中的6种镰刀菌毒素及其衍生物，为真菌毒素的检测拓展了新思路。但此法保留机制复杂，洗脱不稳定，也限制了UPLC-SFC法在多菌毒素分析中的应用。LEI等[30]用异丙醇稀释经13C标记的食用油样品，再经乙腈-饱和己烷萃取，最后以超临界CO2和甲醇作为流动相对萃取液进行梯度洗脱，此方法无需纯化就能在30 min内对食用油中4种AFT完成检测，其检出限为0.05～0.12 mol/ L，RSD<8.5%，形成了一种新的基于超临界流体色谱技术的测定法——SFC-MS/MS法，其在食品痕量分析领域潜力巨大。

2.2.2免疫化学法

1) 酶联免疫法(ELISA法)。ELISA法是把酶的高效催化作用和抗体、抗原的免疫反应有机结合的一种显色检测技术，分为间接竞争和直接竞争酶联免疫法2种形式[31]。马冬月[32]建立农产品中呕吐毒素的酶联免疫检测方法，其通过交叉反应试验证明抗体具有较高的特异性，此法IC50的检出限和灵敏度分别为 0.003 mg/kg和0.03 mg/kg。潘明飞等[33]建立了一种能够快速检测谷物食品中残留AFB1的间接竞争酶联免疫分析方法，成功检测出花生样品中的AFB1含量，检出限为0.006 6 μg/L，灵敏度为0.027 μg/L。目前，酶联免疫检测技术已成为我国粮油食品中国标规定的真菌毒素筛选检测方法，酶联免疫法选择特异性好、灵敏度高且操作简单，但仍存在标记物酶易失活、重复性差、无法多毒素同时检测，难以实现自动化及假阳性概率较高等缺点，且难以满足越来越低的限量标准需求。

2) 时间分辨荧光免疫技术(TRFIA法)。TRFIA法是一种由光激发产生的均相化学发光技术，以稀土元素为荧光标记物，使用时间分辨荧光仪测定荧光信号强度，光信号强度与样品中的分析物浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中分析物的含量。与ELISA法相比，结果稳定性高。张兆威等[34]使用自制时间分辨荧光免疫层析试纸条对不同农产品的AFB1进行检测发现，测定结果与HPLC法检测结果相互验证，检测限为0.3 μg/kg。周彬等[35]利用DON多克隆抗体和光(680 nm)激发产生的均相化学发光技术，通过标记免疫反应建立起均相的DON-AlphaLISA免疫检测法，测定的样品光信号强度与 DON 浓度成反比，此法时间短，稳定性好，有效范围更宽，为0.007～100 ng/mL，灵敏度为0.007 ng/mL，批内批间变异系数均<5%， 无明显基质干扰。TRFIA法灵敏度高、重现效果佳且能一次测定多个样品，不足点在于易受背景荧光的干扰且测定需要的试剂可能损害人体健康，务必要在严密的防护条件下进行操作。

3) 胶体金免疫层析技术(GICA法)。GICA法是将试纸条中的抗体与样液中的特异性抗原结合显色后，经胶体金标记，通过对试纸条显色反应的深浅进行仪器对比读取，从而确定真菌毒素的含量。其在当前的免疫学快速检测方法中以操作简便、时间短、灵敏度强及污染少等优点备受关注，常见于粮油食品在收购、加工和抽查复核过程中快速筛查真菌毒素。杜兵耀等[36]通过对比胶体金免疫层析技术和HPLC技术测定谷物样品中AFB1的检测结果发现，相符率在90%以上，检测时间<5 min，适用于在田间地头建立流动性高的实验室，进行质量监测和大批量粮油食品的筛查检测，但其仍存在样品提取效率低，无法实现多样品同时检测等缺点，需要进一步优化。

4) 放射免疫测定技术(RIA法)。RIA法通过同位素标记靶标并加入特异性抗体检测真菌毒素。闫磊等[37]建立了用CharmⅡ放射免疫法检测牛奶样品中AFT的流程法，通过18次阴性样品空白试验和加标试验，结果全部与液相法交叉验证，表明该方法灵敏度和精密度良好，检出限为0.25 μg/kg。此法前处理简单，测定周期短、效率高，但也容易对其他物质产生污染，成本较高，还需要更进一步的探究优化。

5) 横向流动免疫检测技术(LFD)。LFD的发展源于临床分析中的大分子检测，研究者利用横向流动(LFD)原理研制出一种快速检测OTA的免疫检测方法：先通过筛选和交叉反应找出最优的OTA抗体，然后用染色的血清感光乳胶颗粒对抗体进行吸附固定，通过LFD中的测试线和质控线进行结果定性：2条线均存在时表明样品很少或没有OTA存在；仅有1条时表明样品中有大量的OTA存在[38]。该方法可用于快速鉴别OTA的产毒真菌，对毒素的早期预防有重要意义。

2.2.3电化学生物传感器法电化学生物传感器法通过将生物与电子技术相结合，以物质在溶液中电化学性质规律变化为基础，将微弱的生物化学反应信号转变成可定量的物理、化学信号进行分析测定的一种方法。电化学生物传感器法不仅能快速检测组分复杂的样品，且能连续分析被测物，拥有直观高效、灵敏度高和特异性强等优势，在食品工业领域有良好的应用前景。闫好杰等[39]自制一种核酸适体/捕获探针DNA/羧基化多孔碳-纳米金/氨基化金电极(Apt/c DNA/c PC-Au NPs/NH2-Au E)传感器，以亚甲基蓝为信号反应器，对OTA的检测灵敏度显著提升，检测限为1.0×10-6ng/mL。DALY等[40]利用表面等离子共振(SPR)生物传感器建立黄曲霉毒素的检测方法，通过连续监测分析黄曲霉毒素偶联物和抗黄曲霉毒素抗体作用时折光指数的变化检测真菌毒素的含量，该方法在3～98 ng/mL对AFB1检测具有良好的重复性。SCHNER等[41]用类似的生物传感器检测小麦中DON发现，其工作范围在0.13～10 .00 μg/mL，检测限为2.50 ng/mL，表明该方法检测灵敏度较高。此外，还有以光纤倏逝波和以声表面波为原理设计的传感器，此传感器检测技术的应用，为新技术的研究拓宽了视野，但也存在成本较高和重复性差等缺点，仍需进一步优化。

2.2.4光谱分析法通过光谱分析法快速检测和鉴别待测样品中的真菌毒素类型，并据此进行定性和定量分析，常用于AFT和OTA等真菌毒素的现场检测。该法能从空白样品中筛选出DON污染值>310 mg/kg的样品[42]。KOS等[43]采用中红外(MIR)/衰减全反射(ATR)光谱测定玉米中霉菌毒素的分布情况，并采用完全交叉验证法对最小二乘(PLS)回归模型进行评估发现，经主成分分析/聚类分析(PCA / CA)分类后真菌毒素的分离效率为100%，PLS模型的交叉验证显示相关系数为r=0.992 6，无异常值。SENTHILKUMAR等[44]采用近红外高光谱成像系统(NIR)对储藏大麦OTA污染情况进行动态分析发现，其对大麦各时期OTA的污染程度分析准确性≥82%。QU等[45]建立了一种薄层色谱-表面增强拉曼光谱(TLC-SERS)检测技术，用手提式拉曼光谱仪对薄层色谱分离的斑点进行定性、定量分析鉴别的结果表明，该法检测时间<5 min，AFB1和AFG1检测限分别为1.5×10-6mg/kg和1.2×10-6mg/kg，选择性较高，目前已成功用于现场检测。随着中/近红外(MIR/NIR)光谱技术的发展和数据模型的完善，光谱分析法将在真菌毒素检测领域得到广泛应用。

2.2.5蛋白芯片分析法蛋白芯片分析法是建立在微电子学和生命科学等多学科交叉基础上的一种新方法，其由于分析时间短、多样品参数同时处理及自动化程度高等方面的优势，近年来已成为研究的热点。宋慧君等[46]通过液相芯片技术平台和间接竞争法原理，对偶联抗原浓度进行优化，探索出AFB1抗原抗体结合的最佳反应时间和单抗临界饱和浓度，建立起一套高效的定量检测方法，灵敏度为2.33 ng/mL。

2.2.6荧光光度法荧光光度法是实验室常见的一种分析技术，根据不同真菌毒素的荧光特性，可通过对样品中真菌毒素的提取、纯化，借助荧光分光光度计建立定性及定量分析方法。WANG等[47]利用掺氮碳点和纳米银荧光法，提高了荧光强度，对啤酒和面粉中的OTA进行快速测定的检出限为8.7 nmol/L，有效扩宽了检测范围，缩短了测定时间。该检测技术易普及、分析速度快、操作简便且结果直观，但也存在无法实现自动化的局限性[48]。

3小结

中国作为人口大国，更要重视粮食作物中真菌毒素对人生命健康的严重危害。伴随着科学技术的快速发展和各学科前沿技术的交叉普及应用，真菌毒素检测技术也不断呈现出高效准确和简便低耗的特点，该研究以国内外相关研究为参考，通过对常见真菌毒素的种类、特性及其检出限要求和检测分析技术进行较为全面的综述，及时追踪新方法、新技术的研究进展，不断总结完善，探索适用于行业各层次的在线监测技术，可满足市场对检测方法提出的高效和准确需要，对加强我国食品安全的风险监控，保障行业高质量发展及消费者的身体健康，促进经济社会的可持续发展具有重要意义。