不同孕期胎盘生长因子和血管内皮生长因子水平与胎儿生长受限发生风险的关联分析

刘兆敏， 蒲元林， 吴慧捷， 李 丽

胎儿生长受限(fetal growth restriction, FGR)是造成胎儿死亡的主要原因之一，在所有新生儿中的发生率为5%～10%[1-2]。FGR影响胎儿日后的正常生长发育，如造成神经发育缺陷，增加成年后代谢性疾病和行为失调疾病的发生风险等[3-6]。胎盘生长因子(placental growth factor，PlGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是重要的促血管生成因子，在胎儿的生长发育中发挥重要作用[7-9]。文献报道，PlGF和VEGF或许与FGR的发生和发展相关[10]，孕晚期的血浆PlGF表达水平可能可作为FGR发生风险的预测标志物，注射VEGF可预防小鼠FGR的发生[11-12]。本研究拟探讨不同孕期孕妇血清PlGF和VEGF的表达水平及其与FGR发生风险的关联分析。

1 对象与方法

1.1对象 选取2016年7月—2018年6月在笔者医院进行产前检查的326例孕妇作为研究对象。入组标准：(1)确诊妊娠时间≤8周。(2)年龄20～35岁。(3)同意参与本研究并能进行定期复查。排除标准：(1)患有妊娠期并发症，如妊娠期合并慢性高血压病、糖尿病或肾病。(2)既往生殖系统手术史、肿瘤或严重感染史。(3)多胎妊娠。本研究经笔者医院医学伦理委员会批准，所有受试者均已签署知情同意书。

1.2样本采集及检测 所有受试者入组后分别于孕早期(妊娠≤13周)的10～13周、孕中期(妊娠14～27周)的19～22周和孕晚期(妊娠≥28周)的33～35周，在孕妇静息状态下采集空腹时的外周血于真空采血管中。待其凝固后，在4 ℃、2 000 r/min的条件下离心15 min，分离血清，置于-80 ℃保存以待检测。采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清中PlGF和VEGF的表达水平，每份样本3孔，单次重复。PlGF采用人PlGF试剂盒(美国Abcam公司)进行检测，敏感度2 pg/mL，最低检出浓度 1.372 pg/mL，批次间差别<12%，批次内差别<10%，检测波长450 nm，检测同批进行。另外，VEGF采用人VEGF ELISA试剂盒(美国Abcam公司)进行检测，敏感度低于5 pg/mL，最低检出浓度23.4 pg/mL，批次间差别8.1%，批次内差别4.7%，检测波长450 nm，检测同批进行。同时，为了减少样本放置时间过长可能带来的样本异常从而影响结果的准确性，所有样本为分批次检测，每半年1次。

1.3分组 FGR的诊断采用《妇产科学》第8版教材中的诊断标准[13]。根据FGR的诊断结果将受试者分为FGR组和正常妊娠组。

2 结 果

2.1一般临床资料 入组孕妇的年龄为(29.8±4.4)岁(18～45岁)，妊娠次数为(2.5±0.9)次(1～5次)，生产次数为(1.4±0.5)次(1～3次)，流产次数(1.1±0.7)次(0～3次)。本研究中肥胖(BMI ≥30 kg/m2)、吸烟以及酗酒的孕妇例数分别为45例(13.8%)，42例(12.9%)和13例(4.0%)。总体新生儿的出生体质量为(2 872.3 ± 247.5)g(2 120～3 623 g)，Apgar评分为(9.2±0.6)(7～10)。

2.2孕早期、孕中期和孕晚期孕妇血清PlGF和VEGF的表达水平 326例孕妇中，孕中期和孕晚期的血清PlGF表达水平(均P<0.001)和VEGF(均P<0.001)显著低于孕早期(表1)。

表1 不同孕期PlGF和VEGF表达水平

2.3孕妇血清PlGF和VEGF表达水平在不同孕期中的相关性分析 326例孕妇中，孕妇的孕早期(r=0.227，P<0.001)、孕中期(r=0.288，P<0.001)和孕晚期(r=0.375，P<0.001)血清PlGF与VEGF表达水平均呈正相关。

2.4血清PlGF和VEGF表达水平差别 FGR组的孕早期血清PlGF表达水平和正常妊娠组中比较，差别无统计学意义(P=0.153)；FGR组的孕中期(P<0.001)和孕晚期(P<0.001)PlGF表达水平均显著低于正常妊娠组。FGR组孕早期的VEGF表达水平与正常妊娠组比较，差别无统计学意义(P=0.089)，而FGR组孕中期(P<0.001)和孕晚期(P<0.001)的VEGF表达水平均显著低于正常妊娠组。另外，采用中位倍数法分析结果显示，FGR组孕中期(P<0.001)和孕晚期(P<0.001)的PlGF水平均显著低于正常妊娠组；同时，FGR组孕中期(P<0.001)和孕晚期(P<0.001)的VEGF水平显著低于正常妊娠组(表2)。

2.5不同孕期PlGF和VEGF表达水平与FGR发生风险的关联分析 ROC曲线分析显示，孕妇PlGF孕早期表达水平不能预测FGR的发生风险，但孕中期和孕晚期孕妇的PlGF表达水平均对FGR的发生风险具有较好的预测作用，其中孕晚期PlGF的表达水平对FGR发生风险的预测作用最好，AUC分别为0.577(95% CI：0.466～0.688)，0.762(95% CI：0.674～0.850)和0.900(95% CI：0.845～0.955)(图1A)。孕早期的VEGF表达水平对FGR的发生风险无预测作用，但孕中期和孕晚期VEGF表达水平对FGR的发生风险具有较好的预测作用，其中孕晚期的预测作用最好，AUC分别为0.592(95% CI：0.478～0.705)，0.729(95% CI：0.639～0.819)和0.861(95% CI：0.801～0.920)(图1B)。

3 讨 论

本研究通过检测孕妇血清PlGF和VEGF在不同孕期的表达水平及其表达水平的关联，分析PlGF和VEGF与FGR发生风险的关联，发现：(1)孕中期和孕晚期孕妇的血清PlGF和VEGF表达水平均较孕早期低，且PlGF和VEGF表达水平在孕早期、孕中期和孕晚期均呈正相关。(2)与正常妊娠者比较，FGR患者孕中期和孕晚期的PlGF和VEGF显著降低；ROC曲线表明，孕中期和孕晚期的PlGF和VEGF均可以预测FGR的发生风险，其中孕晚期两者的表达水平对FGR的预测作用最好。

表2 FGR组和正常妊娠组不同孕期PlGF和VEGF表达水平的差别分析

PlGF是VEGF家族的一员，由胎盘滋养层产生，它除了促血管生成作用外，还可以促进有丝分裂，是保证胎盘正常发育的重要物质[14-15]。由于PlGF在胎盘发育和血管生理中的重要作用，参与多种疾病的病理过程[16]。有研究表明，抑制PlGF的表达水平在多种动物模型中(包括视网膜病、脉络膜新生血管性疾病和糖尿病动物模型)可减少新血管形成和毛细血管异常[17]。VEGF是重要的促血管生成因子，其在内皮细胞中具有促进有丝分裂和抗凋亡的作用。同时，VEGF还具有增加血管渗透性和促进细胞迁徙的作用[18]。因此，VEGF在多种疾病中发挥着重要作用，如在多个肿瘤中作为治疗靶点，辅助一些眼科疾病的治疗等[19]。

在正常的妊娠过程中，PlGF的表达水平随着孕周的增长而增加，到达峰值后逐渐下降。与PlGF类似，正常妊娠中VEGF的水平也随着孕周的增加而上升，达到峰值后下降。以往的一些研究显示，PlGF与胎儿异常的生长和发育相关。一项巢式队列研究的结果表明，孕妇32～35孕周时较低的血浆PlGF水平与胎儿低出生体质量显著相关[20]。另外一项回顾性队列研究的结果显示，孕妇血浆PlGF较低可预测孕妇高血压病、不良的围产期结果以及胎儿过低体质量[21]。此外，一项大样本前瞻性队列研究显示，较低的脐带血PlGF水平(采用中值倍数法表示)与较低的出生体质量、不正常的胎儿生长模式及更高的FGR发病风险相关[22]。另外一项回顾性队列研究的结果表明，与分娩适于胎龄儿和大于胎龄儿的产妇比较，发生FGR产妇的母血和脐血中的PlGF水平显著降低，且母血PlGF水平与新生儿出生体质量、头围、腹围以及BMI均呈正相关[23]。VEGF与胎儿的宫内生长发育相关。一项在灵长类动物(狒狒)中进行的实验表明，胎盘基板的VEGF基因输送可以促进子宫动脉重塑，从而促进胎儿生长[24]。VEGF/VEGF受体(VEGF receptor，VEGFR)系统在早期胎儿发育中，或许调控参与犁鼻器化学受体前体以及神经前体迁移[25]。采用VEGF抑制剂KRN633干预孕中期的小鼠可以诱发胎儿小鼠的视网膜血管生长发育异常[26]。孕妇血清VEGF水平的下降和可溶性FMS样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)水平的上升与更高的胎儿的生长和发育受限风险相关[27]。脐带血血浆VEGF水平与胎儿出生体质量正相关，而sFlt-1水平与胎儿出生质量负相关；另外，较高的脐带血VEGF水平与较低的胎儿产后发育迟缓发生风险相关，而sFlt-1呈现相反的趋势[28]。正常足月妊娠的产妇胎盘滋养细胞和血清中的VEGF表达水平显著高于FGR的产妇[29]。

本研究检测不同孕期PlGF在孕妇血清中的表达水平，并评估了其与FGR发生风险的关联，结果显示，孕妇孕中期和孕晚期的血清PlGF表达水平均低于孕早期。同时，FGR患者PlGF孕中期和孕晚期的表达水平与正常妊娠者比较显著下降，且对FGR的发病风险具有较好的预测作用，其中孕晚期PlGF表达水平对FGR发生风险的预测作用最好。PlGF可以预测FGR发生风险的原因可能为：PlGF在胎儿的生长发育中能促进有丝分裂和血管形成，在胎儿的生长发育中起至关重要的作用，较低的PlGF水平可能导致胎儿不能及时完成正常生长发育，故本研究中孕妇血清PlGF随着孕期的进展而下降。

另外，本研究检测了不同孕期VEGF在孕妇血清中的表达水平及其与FGR发生风险的关联，发现孕妇孕中期和孕晚期的血清VEGF水平显著低于孕早期，VEGF孕中期和孕晚期的表达水平在FGR患者中显著低于正常妊娠者，且对FGR发生风险具有较好的预测作用，其中VEGF孕晚期水平对FGR发生风险的预测作用最好。关于VEGF对FGR的预测作用，考虑与以下原因有关：VEGF可以通过调节犁鼻器化学受体前体以及神经前体迁移，促进血管生成从而促进胎儿的正常生长发育，因此，FGR患者的血清孕中期和孕晚期VEGF水平显著低于正常妊娠的孕妇，且孕晚期的VEGF水平对FGR的发生具有较好的预测作用[24-26]。另外，本研究还发现，孕妇血清PlGF和VEGF水平在孕早期、孕中期和孕晚期均呈正比。有研究报道，PlGF可通过促进VEGF与Flt-1受体分离，并促进VEGF与更强的受体VEGF受体-2(KDR)结合，从而增强VEGF的信号传导，这或许可以解释为什么本研究中两者的血清水平在孕早期、孕中期和孕晚期均呈正相关[15]。另外，关于孕期其他因素可能对FGR产生的影响，如妊娠期并发症、妊娠期营养素缺乏等，应在后续研究加入分析。

本研究同时检测了两个血管生成因子PlGF和VEGF与FGR发生风险的关联，且样本量较大，但同时也存在一些缺陷：(1)本研究纳入的受试者多数来自中国同一地区，可能造成结果的代表性不足。(2)本研究为一项观察性研究，可能会产生一些混杂因素，如孕妇的流产史或年龄过大等因素可能会对结果造成影响。(3)本研究采集孕妇的血液样本进行PlGF和VEGF的检测，而血液样本中标志物的表达水平较容易受到其他因素的影响，可能因此导致本研究在评估孕早期、孕中期和孕晚期的PlGF和VEGF表达水平之间的关联时，关联系数普遍较小。(4)本研究未将孕晚期做更详细的划分，可能造成孕晚期的结果对于临床的指导意义较低。(5)另外，本研究未从不同维度评估PlGF/VEGF对FGR发生风险的预测作用，如孕早期、孕中期和孕晚期PlGF或VEGF表达水平的变化趋势或表达量差别对于FGR的预测作用。