地肤子粗提物对变异链球菌作用的体外实验研究

张梦驰， 常 琳， 涂方祥， 卢友光

龋病是一种细菌感染性疾病，变异链球菌是主要的致龋菌。细菌以食物为底物，分解糖产酸，使黏附于牙面的牙菌斑内pH降低，造成局部脱矿，产生龋损。因此，通过抑制变异链球菌的生长、黏附、产酸可以起到防龋作用。天然药物有毒副作用小、不会引起菌群失调的优点，对龋病的预防作用日益受到重视，越来越多针对天然药物防治龋病的相关研究相继出现，如针对非洲的斑鸠菊、榆绿木、藤黄，拉美国家的可可果、血根草，以及中国和日本的中草药、茶的研究[1]。在国内，已有研究发现，厚朴、茶多酚、五倍子等天然药物对致龋菌均有一定的抑制作用[2-4]。地肤子俗称扫帚草，是一种传统的中草药，有抗菌、抗炎、抗敏等功效。地肤子复方制剂对尿路感染、急性乳腺炎及多种皮肤病均有较好的疗效。有研究显示，地肤子有良好的抗病原微生物的作用[5]。因此，本实验主要研究地肤子粗提物对致龋菌(变异链球菌)生长、黏附、产酸的抑制作用，为天然药物地肤子用于龋病的预防提供依据。

1 材料与方法

1.1主要材料和仪器 变异链球菌国际标准株ATCC25175(四川大学华西口腔医学院惠赠)；地肤子(产地河北，购自福州市回春堂大药房，由福建中医药大学车苏容副教授鉴定)；BHI固体及液体培养基，无水乙醇(分析纯)，磷酸盐缓冲液，卡那霉素(EZ2811F23，上海易汇生物科技有限公司)；旋转蒸发器(RE2000，上海亚荣生化仪器厂)；pH检测仪(Sartorius AG，北京赛多利斯公司)。

1.2方法

1.2.1地肤子粗提物的制备 将地肤子研磨成粉，称取100 g置于烧杯中，加入2 L体积分数为80%的乙醇，25 ℃浸提48 h[6]。过滤，弃滤渣得到浸提液，55～60 ℃水浴中负压冷凝旋转蒸发至浸膏状，密封放置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2实验菌株及菌悬液的制备 变异链球菌国际标准株ATCC25175复苏48 h后，接种于BHI液体培养基中，置于厌氧箱(80% N2，10% CO2，10% H2，37 ℃)中培养18 h。涂片检查及生化鉴定为纯培养后，细菌在BHI固体培养基上传代，接种环取固体培养基上的单菌落，用无菌生理盐水将细菌配制成0.5号麦氏管浊度的菌悬液备用[7]。

1.2.3地肤子粗提物对变异链球菌体外生长的影响 称取地肤子粗提物1.0 g，加入10 mL BHI液体培养基，配制成浓度为100 mg/mL的母液，置于高压灭菌器中(0.1 MPa，121.5 ℃)，高压15 min，置于无菌操作台中备用。设置8个实验组和1个阳性对照组。倍比稀释法将母液稀释成8个浓度梯度(0.78，1.56，3.13，6.25，12.5，25，50及100 mg/mL)，设置卡那霉素浓度50 mg/mL为阳性对照组。BHI固体培养基倒板(每平板约5 mL)，凝固备用。BHI固体培养基(低熔点)冷却至室温，加入菌液混合均匀，倒入已凝固的培养基表层(每平板约5 mL)，放入4 ℃冰箱凝固。用已灭菌的小钢管在凝固平板上层打孔，小心挑去小块培养基做成圆孔，每板3孔，共9孔。圆孔中分别注入80 μL实验组及对照组药物，置入4 ℃冰箱中，预扩散2 h，37 ℃厌氧箱中培养24 h，测定抑菌圈大小[8]。实验重复3次。

黏附抑制率=[(对照组OD630 nm-实验组OD630 nm)/对照组OD630 nm]×100%

1.2.5地肤子粗提物对变异链球菌产酸作用的影响 同1.2.4的方法配制4个实验管和1个对照管溶液，混匀。用酸度计将已配制好的实验管与对照管溶液初始pH值调为7.4，厌氧培养箱中培养18 h。18 h后各试管以3 000 r/min离心15 min，取上清液，测定pH值[10]，每管测定3次，结果取平均值，计算pH的变化值(ΔpH)，实验重复3次。

ΔpH=初始pH值(7.4)-终末pH值

1.3统计学处理 采用SPSS 23.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析比较各组总体均数，采用Dunnett-t检验比较多个实验组与对照组均数的差别。P<0.05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2.1地肤子粗提物对变异链球菌体外生长的影响 3次实验中，实验组均未出现抑菌圈，阳性对照组均出现明显抑菌圈，抑菌圈直径平均值1.5 cm。实验表明，在100 mg/mL时地肤子粗提物对变异链球菌体外生长无明显抑制作用(图1)。

2.2地肤子粗提物对变异链球菌黏附作用的影响 随着地肤子粗提物浓度的升高，黏附于试管壁的细菌越少，黏附抑制率也随之增高(图2)。分析结果表明，各浓度组黏附细菌的OD值总体均数不全相等，经Dunnett-t检验，地肤子粗提物4个浓度实验管与对照管比较具有明显抑制变异链球菌黏附的作用。各实验管对变异链球菌黏附的抑制能力与对照管比较，差别均具有统计学意义(P<0.001，图2～3)。

2.3地肤子粗提物对变异链球菌产酸作用的影响

随着地肤子粗提物浓度的升高，ΔpH越来越小，各浓度管抗酸的pH值总体均数不全相等，经Dunnett-t检验，地肤子粗提物4个浓度实验管与对照管比较具有抑制变异链球菌产酸的作用。各实验管相比于对照管，对变异链球菌产酸的抑制能力均有差异性，且差别均具有统计学意义(P<0.001，图4)。

3 讨 论

龋病的发生、发展与致龋菌的生长、黏附、产酸、产胞外多糖等息息相关，而变异链球菌是公认的致龋菌[11]。控制龋病的关键在于预防，目前防龋药物主要包括氟化物、抗生素、免疫制剂等。氟化物应用过量会导致氟牙症及氟骨症。长期使用抗生素防龋会导致耐药及菌群失调。免疫防龋效果目前尚不清楚[12]。而天然药物具有毒副作用小、不会引起菌群失调的优点，在龋病的预防中日益受到重视，相关研究通过探讨天然药物抑制细菌生长、产酸、黏附及促进矿化等的作用机制，研究天然药物防龋效果[13]。

本实验结果表明，地肤子粗提物的浓度为100 mg/mL时，虽然不能抑制变异链球菌的成长，但可抑制变异链球菌黏附及产酸。这与林秀仙等使用超临界萃取地肤子油在高浓度时对金黄色葡萄球菌及链球菌等有抑菌作用的研究结果相似[14]。地肤子的化学成分复杂，主要有萜类及其皂苷、挥发油等[15]，其具体有效活性成分有待进一步筛选。另外，地肤子对变异链球菌合成葡聚糖、菌斑形成及牙体硬组织再矿化等方面的影响及其作用机制也有待进一步探索。