超高效液相色谱-串联质谱法测定谷物和油料中 10 种有机磷农药残留

李婧　俞寅　王丽娟　张云鹏　郝全英

[摘要]本文介绍了谷物和油料中甲拌磷、倍硫磷、乐果、辛硫磷、三唑磷、乙硫磷、马拉硫磷、甲基嘧啶磷、敌敌畏、毒死蜱共10种有机磷农药残留的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定方法。样品经乙腈提取、石墨化碳/氨基固相萃取柱净化;质谱采用电喷雾正离子源和多反应监测模式测定。结果显示，10种农药在0.1～4μg/mL范围内线性关系良好（R2>0.99），方法定量限最低为0.15μg/kg，在20μg/kg、100μg/kg、400μg/kg加标水平下回收率范围为60.6%～113.2%，相对标准偏差为1.21%～14.76%。该方法灵敏度较高、准确度良好，适用于谷物和油料中有机磷农药残留的常规检测。

[关键词]超高效液相色谱-串联质谱;谷物;油料;农药残留

中图分类号：TS207.53 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202006

有機磷农药主要用于农作物的病虫害防治，因其高效、快速、广谱等特点，在现代农业中应用广泛[1]。然而由于有机磷农药的大量使用，农药残留带来的安全问题也越发引起人们的重视。农药中毒可引发头痛、恶心、腹痛等症状，严重者或可诱发癌症，危及生命 [2-3]。因此，世界各国和地区均对食品中农药最大残留限量做出了严格的限制[4-5]。

常见的农药残留检测方法有气相色谱法（GC）[6]、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）[7]、高效液相色谱法（HPLC）[8]、高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[9]等。超高效液相色谱-串联质谱法具有选择性好、灵敏度高、结果精确、分析速度快等特点[10-11]，在农药残留常规检测方面具有广阔的应用前景。

谷物和油料具有低含水量、高淀粉、高蛋白、高脂肪等特点。运用精密仪器分析时，样品前处理过程至关重要，工艺优化关键在于提高目标化合物的提取效率和基质净化程度[12]。谷物和油料中有机磷农药残留检测的前处理方法主要有固相萃取法[13]、凝胶净化色谱法[14]、QuEChERS法[15]等。本研究采用固相萃取技术，对玉米、小麦、稻谷、大豆、绿豆、高粱6种代表性较强的谷物和油料基质进行试验，获得了兼顾回收率和净化程度的良好效果。操作简便、经济节约，适用于谷物和油料中有机磷农药残留的常规检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米、小麦、稻谷、大豆、绿豆、高粱均为市售。

甲拌磷、倍硫磷、乐果、辛硫磷、三唑磷、乙硫磷、马拉硫磷、甲基嘧啶磷、敌敌畏、毒死蜱标准溶液（均为100μg/mL）：农业部环境保护科研监测所。

乙腈（农残级）、甲醇（色谱纯）：迪马科技;甲酸（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司;甲苯（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司;无水硫酸钠（分析纯，用前在650℃灼烧4h，贮于干燥器中，冷却后备用）：天津市凯通化学试剂有限公司;超纯水。

Cleanert S C18固相萃取柱、Cleanert Florisil固相萃取柱、Cleanert PestiCarb/NH2固相萃取柱：天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TSQ QUANTUM Access MAX超高效液相色谱-串联质谱仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司;LM3303保水式盘式粉碎磨：瑞典波通仪器公司;RE-52-99旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂;YC-96数显调速摇床：常州天意仪器厂;ScoutSE电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司;Dura 12F超纯水机：泽拉布仪器科技（上海）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

混合标准溶液：准确移取各农药标准溶液（100μg/mL）500μL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀，得浓度为5μg/mL的混合标准溶液。于4℃冰箱保存，有效期3个月。

基质混合标准工作溶液：取空白样品按1.3.1方法处理，得到基质空白溶液，用其将混合标准溶液稀释成0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL的基质混合标准工作溶液，用于制作标准曲线，现用现配。

1.3.2 样品提取与净化

原料样品经粉碎机粉碎，全部过425μm的标准网筛，混匀备用。

准确称取10g样品（精确至0.01g），放入150mL具塞三角瓶中，加入20mL乙腈，于振荡器上200r/min振荡30min。将提取液过滤至150mL梨形瓶中，残渣再用10mL乙腈振荡提取一次，合并提取液，待净化。

将上述提取液用旋转蒸发器于40℃水浴蒸发浓缩至约1mL，加入6mL乙腈-甲苯溶液（3∶1）复溶。在Cleanert PestiCarb/NH2柱中加入约2cm高的无水硫酸钠，用4mL乙腈-甲苯溶液（3∶1）淋洗活化柱子。下接150mL梨形瓶，将上述复溶液转移至柱子中，用乙腈-甲苯溶液洗涤样液瓶2次，每次5mL，并将洗涤液移入柱中。收集复溶液和洗涤液，用旋转蒸发器于40℃水浴蒸发浓缩至近干。最后用乙腈定容至1mL容量瓶中，供液相质谱分析。

1.3.3 仪器条件

色谱条件：色谱柱Thermo Hypersil GOLD，粒径1.9μm，规格100mm×2.1mm;进样量：10μL;柱温：40℃;流动相及梯度洗脱条件见表1。

质谱条件：电离源模式，电喷雾离子化;电离源极性：正模式;雾化气：氮气;离子喷雾电压：3 500V;离子传输管温度：350℃;鞘气压力：45Arb;辅助气压力：15Arb;监测离子对和碰撞能量见表2。

2 结果与讨论

2.1 提取液量的优化

采用玉米基质，考察了乙腈的加液量对10种农药提取效率的影响。设置A、B、C、D四个试验组，分别在第一次提取、第二次提取时加入乙腈10mL、10mL;15mL、10mL;20mL、10mL;20mL、20mL。测定回收率见图1。结果表明，A、B、C组中第二次加液量为10mL时，随着第一次加液量的增加，各农药的回收率均显著上升。由于干燥的样品粉末在第一次提取时会吸收部分溶剂而溶胀，加液量不足会导致提取效果下降。而当D组中第二次加液量增加至20mL时，回收率较C组无明显上升。因此，本实验最终选择两次提取液量分别为20mL和10mL。

2.2 固相萃取柱的选择

采用玉米基质，考察Cleanert S C18、Cleanert Florisil、Cleanert PestiCarb/NH2 3种固相萃取柱的组合使用对10种农药回收率的影响。Cleanert S C18是一种非极性的吸附劑，可去除提取液中脂肪等有机物;Cleanert Florisil是硅胶键合氧化镁吸附剂，可去除色素和大分子物质;Cleanert PestiCarb/NH2固相萃取柱同时装填有石墨化碳和氨基，可去除色素、脂肪酸、有机酸等干扰物质。基于上述原理，设计Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组试验，分别对C18+PestiCarb/NH2、C18+Florisil和PestiCarb/NH2的净化效果进行研究。玉米基质具有色素、油脂含量高的特点，试验过程中发现，试验组Ⅱ最终定容液颜色较深且粘稠，净化效果不理想，不适用于UPLC-MS/MS仪器分析。使用C18固相萃取柱的试验组Ⅰ，8种农药的回收率低于试验组Ⅲ（见图2），其中毒死蜱由83%下降至75%，倍硫磷由88%下降至82%，这可能是因为Cleanert S C18在吸附杂质的同时，对目标化合物也有不同程度的吸附作用。综合净化效果和对农药回收率方面的影响，本研究最终选择单独使用PestiCarb/NH2固相萃取柱对基质进行净化。

2.3 基质效应

分别用玉米、小麦、稻谷、大豆、绿豆和高粱的空白基质提取液和纯溶剂乙腈配制相同浓度梯度的标准溶液，以各农药的峰面积对浓度绘制标准曲线。基质效应（ME）数值用基质校准曲线的斜率与溶剂标准曲线斜率之比计算，ME<0.8表现为强基质抑制效应;0.8≤ME≤1.2表现为弱基质效应;ME>1.2表现为强基质增强效应。试验结果见表3。每一种农药在某些基质中表现有强抑制或强增强基质效应。因此，试验均采用基质空白溶液配制标准工作溶液进行定量分析，以抵消基质效应的影响。

2.4 线性关系与灵敏度

分别用玉米、小麦、稻谷、大豆、绿豆和高粱6种空白基质提取液，按照1.3.1配制0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1μg/mL、2μg/mL和4μg/mL的基质混合标准工作溶液，进行UPLC-MS/MS测定，绘制标准曲线。以3倍信噪比（S/N≥3）和10倍信噪比（S/N≥10）分别确定检测限（LOD）和定量限（LOQ）。研究表明，在不同基质中，10种农药在0.1～4μg/mL线性范围内均呈现良好的线性关系，相关系数R2>0.99。其中玉米基质的线性方程、线性范围、相关系数、检测限与定量限见表4。10种农药的LOQ范围为0.15～3μg/kg，低于《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2016）规定的农药最大残留限量。

2.5 准确度与精密度

在玉米、小麦、稻谷、大豆、绿豆和高粱6种基质中，对每种农药进行20μg/kg、100μg/kg、400μg/kg三个浓度水平的加标回收试验，每个浓度点平行测定6次。结果表明，10种农药的平均回收率范围为60.6%～113.2%，相对标准偏差（RSD）为1.21%～14.76%，准确度和精密度均符合定量分析要求[16]。玉米基质中10种农药的加标回收率与相对标准偏差见表5。

3 结 论

本文结合固相萃取前处理技术，建立了谷物和油料中甲拌磷、倍硫磷、乐果、辛硫磷、三唑磷、乙硫磷、马拉硫磷、甲基嘧啶磷、敌敌畏、毒死蜱共10种有机磷农药残留的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。该方法对提取液量和固相萃取柱进行了优化，前处理操作简单、净化效果良好，仪器分析线性关系、灵敏度、准确度和精密度均满足定量分析要求，在谷物和油料有机磷农药检测中具有广泛的适用性。

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