碱性蛋白酶水解红豆粉的工艺优化及产物抗氧化活性分析

杨 爽，董艳娇，肖 瑜，张金宝，王 洁

（1. 吉林工程技术师范学院 食品工程学院分子营养重点实验室，吉林长春 130052；2. 江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

红豆是我国的传统谷物之一，也是我国重要的农产品。红豆营养价值丰富，每100 g 含有约20 g蛋白质，0.5 g 脂肪，58.5 g 糖，4.9 g 粗纤维，23.5 g膳食纤维，0.3 mg 维B1、0.11 mg 维B2[1]。红豆被认为是一种高蛋白质、低脂肪的食物。红豆常被加工成多种食品，如红豆饮料[2]、酸奶[3]、酒类[4]和红豆沙[5]等，都受到广大消费者的喜欢。同时，红豆也是药用原料，在药用价值方面研究发现，红豆皂苷和膳食纤维具有良好的调节血压、血糖，以及利尿、通便、解酒、预防肝硬化和结石等作用[6]。我国关于红豆的研究主要集中在黄酮[7]、多酚[8]等多种生物活性成分提取及功能活性研究。而作为红豆主要成分之一，红豆蛋白质是优质的植物蛋白来源，其氨基酸种类齐全，必需氨基酸达到甚至高于FAO/WHO 的要求[9]。与此同时，其蛋白质水提物获得的肽被证明具有抗菌、抗肿瘤[10]活性。虽然红豆蛋白是良好的植物蛋白原料，但红豆目前的加工程度较低，并未得到充分利用开发。

近年来，越来越多研究者通过酶水解蛋白质制备功能活性肽，来实现高效利用蛋白资源的目的。有些蛋白质其组成中部分序列无活性，经过酶解后，释放出来某些序列，才可表现出生理活性，酶水解获得的肽通常由2～20 个氨基酸残基组成，且相关研究表明其水解产物在营养价值方面，其吸收和利用率优于未水解的蛋白质，更能发挥蛋白质的营养作用[11-12]。碱性蛋白酶被广泛用于蛋白质的水解，已有报道关于绿豆肽[13]、花生肽[14]、黑豆肽[15]、大豆肽[16]等肽类的水解工艺研究和功能特性分析。我国有丰富的杂粮品种，红豆作为我国杂粮的一个重要的品种，对其深加工研究却是非常少。所以，试验以碱性蛋白酶对红豆粉进行水解并对其水解产物抗氧化活性进行分析。试验结果可为进一步开发红豆和红豆水解物的应用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红豆，购自超市，蛋白质含量测定为21.6%；碱性蛋白酶（酶的活力数值为1.0×105U/mL），丰瑞生物科技有限公司提供；氢氧化钠、盐酸等，均为分析纯。

粉碎机，速锋有限公司产品；HH-W600 型恒温水浴锅，安庆洁佳仪设备有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 试验流程

红豆→机器粉碎→过筛120 目→调节温度、pH 值、加酶量和酶解时间→水解→沸水浴灭酶10 min→测水解度。

1.2.2 红豆肽的酶解工艺

（1） 单因素试验。①温度。固定质量分数为20%，酶加入量250 U/mL，时间3.5 h，在pH 值为10.0 的条件下，于45，50，55，60，65 ℃的水浴温度环境中酶解，测定水解度。②pH 值。固定质量分数为20%，酶加入量250 U/mL，时间3.5 h，温度55 ℃，测定不同的pH 值（7.0，8.0，9.0，10.0，11.0）条件下水解度。③加酶量。固定质量分数为20%，在pH 值为10.0，时间3.5 h，温度为55 ℃的条件下，测定不同加酶量（100，150，200，250，300 U/mL） 条件下水解度。④时间。固定质量分数为20%，pH 值10.0，温度55 ℃，加酶量250 U/mL，再以时间2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 h 分别测定水解度。

（2） 正交试验。以水解度作为评价指标，以下的4 个因素（温度、pH 值、加酶的量和时间） 为自变量，选择四因素三水平的设定，在单因素试验的基础上进行正交试验，从而进一步优化水解条件。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

（3） 蛋白水解度（DH） 的测定。参考袁斌等人[17]的方法，用pH-stat 法测水解度，计算如下：

式中：B——氢氧化钠用量；

Nb——氢氧化钠质量浓度，mg/mL；

α——校正系数，计算如下：

pK 随温度变化，根据Gibbs-Helmholz 方程计算获得；

式中：Mp——底物蛋白质质量，mg；

Htot——每克蛋白质底物的肽键毫摩尔数，红豆蛋白为7.12。

（4） 水解物的制备。水解结束后，取出沸水浴灭酶10 min，以转速5 000 r/min 离心20 min，取上清液冷冻干燥后密封保存于-20 ℃冰箱中，用于后续试验。

（5） 抗氧化性的测定。

①DPPH 自由基的清除能力。根据Xia Y 等人[18]的方法略作修改，分别配置2，4，6 mg/mL 样品溶液，取0.5 mL 样品液加0.1 mmol/L DPPH 无水乙醇0.5 mL，避光反应30 min，于波长517 nm 处测定吸光度，无水乙醇DPPH 为对照，空白为无水乙醇。计算公式如下：

式中：As——样品吸光度；

Ab——空白吸光度；

Ac——对照吸光度。

②羟基自由基（·OH） 清除能力。参考Halliwell B[19]的方法，分别配置2，4，6 mg/mL 样品溶液，取0.5 mL 加0.5 mol/L FeSO4和H2O2反 应10 min，加0.5 mL 6.0 mmol/L 水杨酸静置30 min，于波长510 nm测定吸光度（As），去离子水为空白（Ab），水杨酸和样品为对照（Ac）。计算公式如下：

式中：As——样品吸光度；

Ab——空白吸光度；

Ac——对照吸光度。

③还原力测定。参考Lu R R 等人[20]的方法，分别配置2，4，6 mg/mL 样品溶液，取0.5 mL 样品液，配制成质量分数为1%的铁氰化钾溶液，于50 ℃下反应20 min，加10%的三氯乙酸终止反应，以转速4 000 r/min 离心10 min，取0.5 mL 上清液加等体积去离子水，加0.1% FeCl3溶液0.4 mL （W/V），在50 ℃下反应10 min，于波长700 nm 处测定吸光度为还原力，空白为去离子水。

④Fe2+螯合能力。分别配置质量浓度为2，4，6 mg/mL 样品溶液，取1 mL 加2.0 mL 氯化亚铁和菲洛嗪反应10 min，于波长562 nm 处测定吸光度（As）。去离子水代替样品为空白（Ac），计算公式如下：

1.3 统计学分析

每个试验至少做3 次平行试验，结果表示为平均值±标准差。试验数据采用SPSS 22.0 软件进行方差分析与相关性分析，使用OriginPro 8.5 软件制作分析图表。

2 结果与分析

2.1 酶解温度对水解度的影响

酶解温度对蛋白水解度的影响见图1。

由图1 可以看出，酶解温度在45～55 ℃，水解度随酶解温度升高而增大，当酶解温度大于55 ℃之后，随着酶解温度提高水解度发生了降低的情况。出现这种情况是因为酶的活性和温度有关[21]，当温度高于酶的最适反应温度，酶的活性降低。

2.2 pH 值对蛋白水解度的影响

pH 值对蛋白水解度的影响见图2。

由图2 可以看出，随着pH 值的增大，水解度在图中总体看来呈现上升趋势，酶的反应活性强度和pH 值的大小是有关系的。如图2 所表现的pH 值为11 时，水解度到达了试验的最大值为19%，并逐渐趋于平缓。综合考虑生产成本及实际生产所需条件，后续正交试验选择的pH 值为9～11。

2.3 加酶量对水解度的影响

加酶量对蛋白水解度的影响见图3。

由图3 可以看出，随加酶量的增大，水解度也在图中总体出现增大的变化。在加酶量100～250 U/mL下，随着酶量增加水解度不断增加。而当加酶量为300 U/mL，水解度降低，这说明加酶量过大时不利于水解反应，产物中可能存在抑制酶作用的成分[22]，反应不再进行，从而使水解度发生下降。

2.4 酶解时间对水解度的影响

酶解时间对蛋白水解度的影响见图4。

由图4 可以看出，酶解时间对水解度有明显的影响（p＜0.05），在2.5～3.5 h 时，水解度随酶解时间的延长逐渐增加；在3.5 h 时，水解度最高为17.8%。而进一步延长酶解时间，水解度不再增大而是出现降低现象。

2.5 最佳酶解工艺条件的确定

正交试验结果见表2。

由表2 可以看出，在测定影响水解度的因素试验中，4 个因素对水解度的影响主要程度依次为酶用量＞pH 值＞时间＞温度。由正交试验数据极差分析可知，最好的组合是A2B3C2D2，但表2 中4 号试验组A2B1C2D3的结果是最高的，为19.4%，和优选组合不一致，然后用优选组合的结果A2B3C2D2与第4 号组进行再一次的试验求证，求证结果显示优选组合方案A2B3C2D2水解度是20.67%，所以最好的组合是A2B3C2D2，即温度55 ℃，pH 值11，加酶量250 U/mL和时间3.5 h，最适用于红豆的水解。

表2 正交试验结果

2.6 抗氧化活性

不同质量浓度水解物见图5。

不同质量浓度样品均显示了对DPPH 自由基有良好的清除能力（20.95%～33.09%），且样品质量浓度与DPPH 自由基清除率密切相关。羟基自由基可激活脂质过氧化反应，与几乎所有相邻的生物分子可发生反应。这种损伤可导致多种疾病，因此它的清除是预防食物腐败和某些疾病发生的最有效的方法之一[22]。红豆水解物具有较强的羟基自由基清除能力（30.91%～54.6%），可用于预防食物腐败，使其免受羟基氧化的危害。图5（c）中显示了红豆水解物Fe2+螯合能力，Fe2+螯合能力随着质量浓度增加，从15.94%增加到30.01% （p＜0.05）。红豆水解物具有较好的金属离子结合能力。图5（d） 显示了水解物的还原力，如图所示，红豆水解物具有一定的还原能力（0.17%～0.3%），高于大麦谷蛋白酶解获得的水解产物还原力（0.121，2 mg/mL）[18]。以上结果表明，红豆水解物具有良好的抗氧化能力，且抗氧化活性与质量浓度相关。

3 结论

选择碱性蛋白酶水解红豆，制备水解物，并分析其水解产物抗氧化活性，以期提高红豆资源利用率。结果表明，碱性蛋白酶最适水解条件为温度55 ℃，pH 值11，加酶量250 U/mL 和酶解时间3.5 h，此时蛋白水解度20.67%。在此参数下获得的水解物的DPPH 自由基清除能力、羟基自由基清除能力、Fe2+螯合力和还原能力，随质量浓度的增加而增强，表明碱性蛋白酶水解红豆获得的水解物具有较好的抗氧化活性，其可作为一种潜在的抗氧化多肽进行开发。