外泌体microRNA的生物学特征及在肝纤维化发生发展中的作用

张诗琬，喻雪琴，陈 芳，梅怡晗，梅小平

1 川北医学院附属医院 感染科，四川 南充 637000； 2 首都医科大学朝阳医院 感染科，北京 610041

肝纤维化是肝组织炎症反应发生后组织修复过程中细胞外基质过度沉积后的一种病理结果，其具体发生机制尚不明确，但纤维化的发生与肝星状细胞(HSC)的激活、成纤维细胞与其他细胞间信息传递失衡关系密切，如与一氧化氮酶活性程度、转化生长因子β(TGFβ)等细胞生长因子水平表达失衡等显著相关。外泌体是通过细胞胞吐作用而释放的一种膜性泡体，生物活性分子蛋白质、脂质及核酸等物质包裹在膜性泡体内，而且核酸内包含mRNA、microRNA(miRNA)等信息物质，在细胞间通过信号物质传输、信息传导与交互来参与对靶细胞的各种生理与病理活动[1]。外泌体miRNA作为细胞间信号传导的桥梁之一，研究表明，其对细胞外基质的形成与降解发挥了关键性的调节作用。作者认为，外泌体miRNA有可能成为未来肝纤维化诊治的潜在新型生物学指标。本文就外泌体miRNA的形成与生物学特点及在肝纤维化发生机制中的作用做一综述。

1 外泌体miRNA的形成与生物学特点

1.1 外泌体miRNA概述 来自于人体组织细胞可通过生物信号分子的传导与漂移来介导细胞间交换，又称细胞间通讯，是多细胞生物体信号交互的一种手段。细胞外囊泡作为一种重要的生物分子载体，在细胞通讯中起着非常重要的载体作用，可分为外泌体、微泡及凋亡小体三个亚群[2]。外泌体由科学家于1987年首次在绵羊网织红细胞中发现并命名为“exosomes”[3]，其由细胞内多囊泡体形成，多经淋巴细胞、肝细胞、HSC、间充质干细胞等分泌释放到人体的内环境中。Yez-M等[4]研究发现，在人体血液、尿液、唾液、脑脊液等体液中均有外泌体miRNA等的表达与存在。细胞分泌的外泌体膜性囊泡内含mRNA、miRNA等生物活性分子，人体外周血中miRNA的主要信号分子来源就是外泌体[5]，外泌体通过将其内的miRNA等信号分子传递给其他细胞来完成细胞间的信号交换，从而调控靶器官或细胞内(间)的各种生理与生化活动。

1.2 外泌体的形成 机体细胞内的外泌体合成以细胞膜内陷内吞作用形成具有脂质双分子层的内吞囊泡为起始步骤，随后其核内胞膜再次发生内陷使之分隔成多腔内小囊泡，其特异性的内容物在重组与运转蛋白作用下，选择性地包裹胞内mRNA、miRNA、脂质等物质形成终末期内体，随后终末期内体以内出芽模式形成管腔状囊泡，即多囊泡体[6]，其细胞胞浆中miRNA等物质与一些跨膜分子蛋白进入囊泡内，囊泡膜随之与胞膜融合，再次发生囊泡膜内陷形成颗粒囊泡，随之颗粒囊泡分泌释放至胞外形成外泌体[7]。信号蛋白Rab、GTP蛋白及下游信号分子GEF和GAP等一些小分子蛋白参与了外泌体的形成与分泌，多囊泡体通过微管驱动蛋白及动力蛋白来供给动力以发生漂移，Rab7与下游靶蛋白Alix和TSG101来调节多囊泡体的运动方向[8]。

外泌体通过胞吐作用将miRNA、mRNA等信号物质释放至胞外并与靶细胞特异性融合，将其所含miRNA、mRNA等信号物质传递给靶细胞以此来调节靶细胞中的蛋白表达、免疫功能、细胞增殖、分化及凋亡等各种生理病理过程。靶细胞可通过以下三种模式来发挥信息交换与传导：(1)外泌体膜上磷脂酰丝氨酸与活化的T淋巴细胞及巨噬细胞膜上的T1MI、TIM4等受体结合形成复合体，再与靶细胞膜上的整合素αvβ3、αvβ5结合；(2)靶细胞直接发挥内吞作用将外泌体吸收；(3)外泌体膜上特异性受体与靶细胞膜上相应配体结合，从而将内容物传递给靶细胞[9]。

多囊泡体内miRNA、mRNA等信号物质分泌释放至细胞外被靶细胞吸收是多囊泡体在细胞内的去向之一。另外，胞内多囊泡体与溶酶体融合后的酸性水解酶可降解多囊泡体内的miRNA、mRNA等信号物质。最新研究[10]结果显示，外泌体可以胞膜内出芽模式释放到细胞外，也可以细胞内质膜连接隔室发生出芽而延缓释放。总之，外泌体的合成及释放机制目前尚不明确，但可以肯定的是多囊泡体内miRNA、mRNA等信号物质可以外泌体形式释放出细胞外，以外泌体为载体完成细胞间信息传递与交流，从而起到对疾病发生发展的调控作用。

1.3 外泌体的生物学特点 研究发现，外泌体作为一种细胞分泌释放的微型小囊泡，内含miRNA、mRNA等信号物质，外泌体作为信号物质的载体，可通过配受体结合或细胞间直接接触发生吞噬或融合作用,将mRNA、miRNA等信号物质传递出去，是实现细胞间信号物质与信息交流的重要载体。

由于来源于不同组织细胞的内含物不同，外泌体间存在不同种类，但都有相同的蛋白分子，如膜转运蛋白、融合蛋白、热休克蛋白、整合素与跨膜蛋白超家族中的CD9、CD63及CD81等。其中CD9及CD81作为外泌体特有蛋白分子，可作为外泌体特有的生物学标志物[11]。来源不同的外泌体miRNA功能差异较大[12]，如被病原菌感染过的细胞分泌的外泌体就包裹有病原体相关抗原；来源于T 、B淋巴细胞的外泌体，可表达T、B淋巴细胞相应的受体，并具有黏附受体的作用。相对应的，肝脏发生纤维化后，肝脏细胞分泌释放的外泌体内就含有与肝纤维化发生密切相关的信号分子，如miRNA-122、miRNA-19a、miRNA-214等，并且在脂肪堆积的脂肪肝中，肝细胞受到脂肪酸损伤后会产生一种类外体小泡，其内含有miRNA-17-92，随之被HSC内吞，进而发生肝纤维化[13]，通过对外泌体中miRNA、mRNA等信号物质的性质、活性及表达量的分析将对肝纤维化等疾病的发生机制与诊治有重要的指导作用。

外泌体内容物所含核酸种类最多的是RNA，只有一些特定的RNA才会进入外泌体内从而被分泌，外泌体所含RNA与细胞中RNA差别较大，外泌体RNA一般不超过200个核苷酸[14]，主要由miRNA、mRNA、tRNA、lncRNA等非编码核苷酸构成，这些外泌体所含RNA具有相应的调节功能，在被转运到靶细胞后，可翻译成蛋白质来发挥其特有功能，如外泌体所含特定miRNA被传递到靶细胞后，可通过修饰相应的靶miRNA来调节其相应基因的表达及功能。

外泌体是人体循环血中miRNA的主要来源，外泌体中miRNA在脂质双分子膜保护下能够不被RNA酶所降解，保持其在细胞、靶细胞与体内结构和功能的稳定性，使其在人体血液等体液中结构与表达水平能被稳定地检出，不同病生状态下循环血清中miRNA水平表达的差异性较大。因此外泌体中miRNA可能成为肝纤维化等疾病诊治、预后评估等可靠的潜在新型生物学指标。

2 外泌体miRNA与肝纤维化

2.1 外泌体miRNA对肝纤维化发生的调节作用

2.1.1 外泌体miRNA对HSC的影响 有研究发现，外泌体miRNA相关基因表达与HSC活化、增殖、凋亡等生理活动密切相关。HSC是细胞外基质的主要来源，是肝纤维化发生发展的中心环节，miRNA可通过其信号传导与物质转导等途径来调控靶细胞内相关肝纤维化基因的转录及水平表达，来源于外泌体内的miRNA对HSC激活、增殖、凋亡、漂移等生理过程有重要的调节作用，能诱导HSC的活化、增殖来促进肝纤维化的发生。

Seo等[15]研究发现，受损伤肝细胞可释放众多外泌体所有的自体RNA，并携带Toll样受体3(TLR3)配体，能与HSC膜上的TLR3结合并诱导和促进HSC的激活、增殖，从而促进HSC表面的CC类趋化因子配体20(C-C motif chemokine ligand 20，CCL20)水平高表达，而CCL20可诱导高表达的CCR6+和γδT淋巴细胞聚集，抑制HSC凋亡，促进γδT淋巴细胞分泌大量的IL-17A，进而促进肝纤维化的形成。

Chen等[16]研究发现，HSC可分泌外泌体miRNA-214并在CCL20等趋化作用下黏附在附近的HSC或肝细胞膜上，促进同一细胞或不同细胞间信息传导，其研究发现，肝组织发生纤维化时，促纤维化的结缔组织生长因子(CCN2)水平高表达，这与低水平表达的miRNA-214呈负相关，提示miRNA-214对HSC的活化、增殖发挥了抑制作用，作者认为，通过外泌体miRNA-214与CCN2 3′-UTR的结合来抑制CCN2水平的表达，可下调其下游靶细胞基因表达。在肝组织纤维化时，HSC通过激活多条信号通路来下调miRNA-214水平表达，从而对CCN2的抑制作用减弱，因此，外泌体miRNA-214低水平表达可能是致肝纤维化发生的诱发因素之一。研究[17]发现，激活后的HSC可促进分泌释放含转录调控因子Twist1外泌体的低水平表达，而Twist1可抑制miRNA-214的水平表达而减弱miRNA-214对CCN2的抑制作用，随后受体细胞促进CCN2的表达水平上调，促进了α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及胶原蛋白水平高表达，诱导和促进了肝组织纤维化的发生发展[18]。

受损肝细胞、内皮细胞不仅参与HSC的活化，还参与了HSC的漂移过程，内皮细胞外泌体分泌鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase 1，SK1)，并通过纤连蛋白及整合素介导附着在HSC膜上，在动力蛋白2的作用下以内吞模式进入HSC内，从而激活HSC及与肝纤维化发生相关的AtK信号通路，外泌体miRNA的激活促进了致肝纤维化miRNA的漂移进而促进肝纤维化的发生[19]。而SK1的活化与成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor-2，FGF-2)密切相关，有研究[20]结果显示，FGF-2对外泌体miRNA的释放有显著的调节作用，SK1的靶蛋白是鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine 1-phosphate，S1P)，高表达的SK1可促进S1P水平高表达而趋化HSC的聚集与活化，同时还激活丝氨酸/苏氨酸激酶来调控HSC的活化、增殖与漂移能力，从而发挥对肝纤维化发生发展的调节作用。有学者[21]通过动物实验发现，经过四氯化碳处理后发生肝纤维化的小鼠，其循环血中来源于外泌体的miRNA水平明显上调，促进了HSC的活化、增殖及细胞外基质的形成，这可能与SK1/S1P有关，研究结果提示调控外泌体miRNA水平表达可能是抗肝纤维化治疗的潜在手段和研究方向。

2.1.2 外泌体miRNA对肝纤维化标志物水平的影响 肝细胞受损后分泌释放的外泌体miRNA可提高HSC活化以及增殖的标志性蛋白α-SMA、纤维化标志物TGFβ受体Ⅱ、Ⅰ型胶原蛋白α2的高表达，这与外泌体miRNA-17-92[22]等高表达关系密切。有研究[13]表明，在肝细胞受到脂肪酸侵害时，就会分泌释放含有miRNA-17-92的囊泡小体，HSC可进行吞噬从而激活肝纤维化。同时抗纤维化的miRNA水平表达与肝细胞受损程度及修复后肝纤维化水平密切相关，如外泌体miRNA-122可增强肝组织再生基因丝裂原活化蛋白激酶及低氧诱导因子等的水平表达来参与肝组织纤维化的发生[23]。Devhare等[24]研究发现，HBV、HCV感染后的肝细胞会释放一种外泌体(HCV-exo)促使HSC发生内吞作用以促进纤维化标志物水平升高，特别是miRNA-19a的高表达。肝细胞与HSC之间通过外泌体miRNA来实现细胞间信息介导和表达并调节肝纤维化的发生发展。

2.2 外泌体miRNA在肝纤维化诊断中的作用 外泌体与其他细胞膜接触融合后将利用外泌体内的脂质双分子层膜来保持miRNA结构与功能的稳定性，并传递到靶细胞内完成细胞间的信息交换，从而发挥对HSC活化、增殖的调节作用。Devhare等[24]研究发现，HCV感染后的肝细胞可释放外泌体miRNA-19及靶向分子SOCS3至HSC膜上，并与相应受体结合后促进HSC的激活与增殖，且慢性HCV感染所致的肝纤维化患者血清中miRNA-19a水平较健康体检者明显升高。有学者认为，循环血清中外泌体miRNA-19a水平可能成为肝纤维化程度及预后评估的潜在新型生物学指标之一。研究发现，外泌体miRNA-214在活化的HSC中低表达，对CCN2抑制作用减弱导致其表达上调，CCN2水平不仅受到外泌体miRNA-214水平影响与调控，且CCN2可被外泌体包裹，由HSC释放到体液中，介导HSC活化与信息传导，提示外泌体miRNA-214及CCN2、Twist1等信息分子间相互作用对肝纤维化发生过程具有调控作用。外泌体miRNA在人体尿液、血液、脑脊液等体液中虽然表达微量但均可检测，因此外泌体miRNA-214有望成为肝纤维化程度评估指标，可能成为一种新的肝纤维化诊断的非侵入性的潜在生物标志物。研究[13]表明，纤维细胞也可分泌释放外泌体，且包含miRNA-21、miRNA-142a、miRNA-125b、miRNA-126、miRNA-130a以及miRNA-132等活性分子，这些活性物质对胶原纤维的产生有着促进作用，在人体组织损伤、伤口愈合的早期有利于胶原纤维的堆积，促进伤口愈合，因此在肝脏发生纤维化时，纤维细胞分泌的外泌体中这些信号分子的表达增高，可作为辅助诊断肝纤维化的生物学标志物。

2.3 外泌体miRNA对肝纤维化治疗的影响 外泌体miRNA可通过各种途径影响HSC活化与增殖，抑制HSC凋亡可促进肝纤维组织增生，但有研究发现，来源于干细胞的外泌体可通过抑制肝纤维化相关因子及信号通路来发挥抗肝纤维化作用。

Hyun等[25]研究发现，来源于绒毛膜板的间质干细胞外泌体miRNA-125b可通过抑制Hedghog信号通路来阻止肝纤维化发生。Li等[26]在研究四氯化碳与小鼠肝纤维化关系的实验中发现，来源于人脐带的间充质干细胞外泌体miRNA可通过抑制TGFβ/Smad信号通路、减弱p-Smad2水平表达来抑制α-SMA、细胞外基质合成以降低其表达，同时也抑制肝细胞上皮-间充质转化过程，从而减轻肝细胞受损程度。Tan等[27]研究发现，来源于间充质干细胞的外泌体miRNA可通过上调细胞内蛋白质代谢周期及肝细胞中增殖细胞核抗原表达来提高肝细胞的增殖，促进肝细胞的再生和肝功能的修复。

有研究[28]表明，来源于脂肪组织的间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymalstem cells，ADSCs)的外泌体miRNA可抑制TGFβ1的水平表达以调控肝纤维化的发生。由肝脏Kupffer细胞产生的TGFβ1，可促进HSC活化并诱导HSC增殖，活化的HSC可促进TGFβ1高表达，在成纤维细胞活化与增殖后可促进细胞外基质水平升高从而导致肝纤维化的发生。TGFβ1的启动子有两个State3结合位点，在活化的HSC中，激活后的State3可促进TGFβ1水平升高导致肝纤维化的发生。同时State3可通过MAPK/ERK信号通路上调Bcl-2的表达[29]，ADSCs来源的外泌体miRNA通过与靶细胞膜融合并向靶细胞传递信号后下调HSC中State3及Bcl-2水平表达，从而使TGFβ1水平下调，抑制HSC活化与增殖，外泌体miRNA下调下游靶基因TGFβ1水平来抑制TIMP-1和PAI-1等信号通路活性，从而抑制胶原蛋白、α-SMA、纤维黏连蛋白合成与水平表达，发挥抗肝纤维化作用[28]。Nong等[30]研究发现，来源于间充质干细胞的外泌体miRNA对大鼠肝缺血再灌注后的炎症反应及氧化应激反应可起到明显的抑制作用，减轻了肝脏再灌注后的损伤程度。

肝组织受损后，不同细胞来源的外泌体miRNA通过各种途径来促进肝纤维化的发生，同时肝纤维化过程也受到外泌体miRNA的抑制作用，减轻肝组织的纤维化进展，这可能与HSC的活化、增殖及细胞外基质形成关系密切。上文提到CCN2是一种对HSC活化、增殖、迁移起着重要作用的促纤维化活性因子，其表现出非常活跃的成纤维细胞特性，促进了细胞外基质的沉积，加速了肝纤维化进程。miRNA-214与CCN2呈负相关，静止型HSC会释放出一种抑制HSC活化及纤维生成的外泌体，这些外泌体将miRNA-214、miRNA-199a-5p以及Twist1传递给受体HSC，直接抑制CCN2的转录，从而抑制下游靶基因的表达，胶原纤维生成受阻，并且使活化的HSC恢复到更安静的表型[13]。由此可见，外泌体miRNA将来可能被用于肝纤维化的治疗，也许会成为肝纤维化诊治和预后评估的新指标。

总之，外泌体miRNA作为一种新型信息分子，现已发现有2838 种miRNA和3408种mRNA，其在肝纤维化中的表达变化及其与肝纤维化的关系和作用机制尚不清楚。外泌体miRNA对肝纤维化过程中炎性反应、HSC活化、增殖与凋亡、细胞外基质沉积都有明显抑制与促进的双重作用。外泌体miRNA在人体体液中易被稳定检出，因此其可能作为肝纤维化程度、诊断及预后评估的新型生物学标志物。但目前对外泌体miRNA在肝纤维化发生机制中作用的研究较少，能特异性反映肝组织纤维化的外泌体miRNA也较少，未来还需要更多的加强基础研究与临床应用验证。来源于干细胞的外泌体miRNA可对肝纤维化进程产生抑制作用，减轻肝组织炎症，促进肝组织炎症及功能恢复，作者认为，干细胞源性的外泌体miRNA在肝纤维化治疗方面有较好的研究前景，可能成为未来抗肝纤维化治疗的潜在新靶点。