环状 RNA与糖尿病及其并发症

2020-12-14白雨刘文虎

临床肾脏病杂志 2020年5期

白雨刘文虎

100050 北京，首都医科大学附属北京友谊医院肾内科

近30年来，我国糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率逐年上升，全球近三分之一DM患者为我国患者[1]，其中大多数为2型DM(T2DM)[2]。据调查，全球超过4.15亿人口患有DM，且据估计截止至2040年，DM人口将增长至6.42亿[3]。T2DM是由遗传因素和环境因素共同作用而形成的多基因遗传性疾病，是一种复杂的异质性的糖代谢性疾病，主要包括高血糖反应、胰岛功能受损和(或)胰岛素分泌障碍，可引起多器官或组织功能失调，其并发症包括：心血管疾病、肾脏损伤、视网膜病变、周围神经病变，皮肤损伤等[4]。目前已知T2DM及其相关并发症的发病机制包括蛋白激酶C通路、多元醇通路的激活，糖基化终末产物(advanced glycation ends，AGEs)、活性氧所致的组织损伤，炎症反应及细胞因子及表观遗传学变化等[5]，其中表观遗传学变化(DNA甲基化和非编码RNA)已逐渐成为研究热点[6]。

非编码RNA(non-coding RNA)分为微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、环状RNA(ciraclar RNA,circ RNA)等，虽不参与基因编码合成蛋白，但却发挥着多种重要生物学功能[7]。circ RNA是一种3′端与5′端相互连接的闭环非编码RNA。由于检测手段的限制，circ RNA曾被误认为是转录错误的无功能RNA，随着检测手段的不断提高，circ RNAs被证实为有功能的非编码RNA[8]。与线性RNA相比，circ RNA稳定性更强(因其呈闭合环状结构，缺乏线性RNA的5′和3′游离末端，不易被核酸外切酶降解)，多数circ RNAs在不同物种间具有高度的保守性[9]。近年研究提示，circ RNA在多种疾病的发生、发展中发挥作用[10]。本文将针对circ RNA的结构特点、生物学功能及其与DM、DM相关并发症的关系进行综述。

一、circ RNA简介

1.circ RNA结构特点及检测手段 circ RNA是一类以3′-5′磷酸二酯键形成环状结构的长链非编码RNA[8]。20世纪90年代，研究者首次发现circ RNA的存在，在此后的20年中，由于检测手段受限，circ RNA被认为是基因表达过程中产生的无功能RNA，未得到重视。具体原因有以下几点：(1)circ RNA与miRNAs和其他小RNA不同，不容易通过大小或电泳迁移率与其他RNA分离；(2)当时使用的扩增和(或)片段化的分子技术破坏了其环状结构；(3)circ RNA没有游离的3′或5′端，它们不能通过依赖于多聚腺苷化的游离RNA末端的分子技术，如cDNA末端的快速扩增(RACE)或Poly(A)富集，用于RNA-seq研究的样品[11]。

随着实验技术的不断进步，这些circ RNA研究相关的瓶颈问题近期正逐步得到解决。基于circ RNA的一些特点，研究者发现以下几种方法可以区分circ RNA及线性RNA。研究发现，通过提高凝胶的交联程度，可使circ RNA的迁移率较线性RNA更慢，在二维凝胶电泳中，circ RNA通过高度交联凝胶的迁移能力较差，在凝胶陷阱电泳中，circ RNA与融化的琼脂糖混合后被交联捕获，在外加电场中不迁移[12]。此外，使用弱水解或靶向RNase H处理circ RNA，使其降解为多个大小可预测的线性RNA[13]。使用RNase R外切酶、烟酸磷酸酯酶和终止外切酶处理使circ RNA保持完整，但能有效降解大多数线性RNA[13]。以上3种方法可用于circ RNA的富集，但仍存在一定局限性，需要相互结合使用才能得到更可靠的研究结果。需要注意的是，套索RNA是在典型的RNA剪接过程中形成的，其在剪接点存在一个2′-5′碳键，因此在生物化学特性上不同于circ RNA。因此，在外切酶消化之前，可以先用去分支酶处理，从circ RNA中去除套索RNA。

此外，circ RNA相关的新型生物信息学工具(如CircleSeq)、具有长读数和高通量的测序技术(高通量平行测序技术)以及耗尽核糖体RNA(RRNA)的RNA文库(而不是poly A富集文库)的测序技术的出现，circ RNA的研究难点被逐步攻克，越来越多的研究者聚焦于circ RNA的生物学特点研究及其在机体生理、病理状态下的生物学功能的相关研究[10]。

2.circ RNA的生物学功能

(1)miRNA海绵：miRNA是一种非编码RNA，具有多种基因的调节功能，但一些实验发现在某种情况下miRNA会失去功能。Margaret等[14]发现miRNA可被含有其反义核苷酸的RNA吸附，竞争其结合位点起到阻断其生物学功能的作用，可解释miRNA失去功能的机制。此后，多项研究证实，circ RNA具有多个miRNA结合位点，竞争性吸附miRNA，阻断其相应的生物学功能。因此，circ RNA被称为“miRNA海绵”。circ RNA的“miRNA海绵”作用是目前发现circ RNAs发挥功能的主要途径[15-16]。

(2)调控转录：RNA的环状化可以调控基因的转录[11]。有研究者推测circ RNA可作为“mRNA陷阱”(mRNA trap)，隔绝翻译起始点，非编码RNA增多，编码RNA减少，进而减少相应蛋白的表达水平[17]。这一观点在其他研究中得到证实。在人源及鼠源细胞的HIPK3基因的表达过程中，circ RNA的表达水平高于线性编码RNA，且circ RNA的表达水平与线性编码RNA的蛋白质产物水平呈负相关。可见，基因选择性表达促使RNA环状化是调控蛋白翻译的机制之一。此外，在多种疾病中，RNA环状化水平改变被认为是潜在的发病机制。

(3)与RNA结合蛋白(RNA bonding protein，RBPs)相互作用：circ RNA可与RNA结合蛋白结合，发挥一定生物学作用。Memczak等[18]在针对circ RNA CDR1as的研究中发现，circ RNA CDR1as可与AGO(一种miRNA结合蛋白，与miRNA结合发挥作用)相结合。研究者推测，circ RNA与RBPs相结合后增加了自身的稳定性，并可促进相应DNA增加circ RNA的转录，同时竞争性结合RBPs，使miRNA降解增加，抑制miRNA生物学作用[19]。

(4)翻译模版：一些circ RNA内部含有连续型开放阅读框，真核细胞40S核糖体可翻译含内部核糖体进入位点的circ RNA，但Jeck等[17]研究提示，虽然一些circ RNA含有AUG翻译起始点，仍不能与核糖体结合。关于circ RNAs作为翻译模版的生物学作用有待进一步深入研究。

二、circ RNA与DM

Stoll等[20]检测了2型DM患者及DM动物模型胰岛组织中circHIPK3和ciRS-7的表达水平，发现DM患者胰岛组织中circHIPK3和ciRS-7的表达水平显著升高，而在DM动物模型胰岛组织中其表达水平则明显降低。circHIPK3通过阻断miR-124-3p和miR-338-3p调控Slc2a2，Akt1和Mtpn等基因，影响胰岛β-细胞的分泌功能。ciRS-7则通过阻断miR-7发挥相应作用，影响β-细胞功能。

Li等[21]收集2型DM患者、冠心病患者及健康人群的外周血进行circ RNA微阵列分析发现40种差异表达的RNA(13种上调，27种下调)，从中筛选出5个表达差异显著的RNA应用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)在各组相应队列中进行验证，最终结果表明has-circ-11783-2与2型DM及冠心病密切相关。has-circ-11783-2的源基因是ENST00000251081，其编码产物是桥粒胶蛋白亚家族成员，有研究证实此基因突变与心脏疾病存在相关性，但尚无研究证实其与DM相关[22]。因此，has-circ-11783-2与DM的关系需要进一步实验证实。Zhao等[23]采集了2型DM患者和健康人群的外周血进行circ RNA微阵列分析，并在临床队列中进行验证，发现has-circ-0054633表达差异显著，基因分析提示has-circ-0054633参与了细胞周期调控过程及细胞内分子代谢，与胰岛β细胞及胰岛素分泌密切相关。王思思等[24]研究者通过生物信息学技术筛选了3个胰岛素信号通路相关的circ RNA，收集 50 例新诊断T2DM患者、40例IFG患者及50名体检健康人群的临床资料，检测生化指标及相关circ RNA水平。研究结果提示，在DM患者血清中hsa_circ_0056891、hsa_circ_0063425、hsa_circ_0071336 表达水平降低，调整多个因素后统计学分析结果提示hsa_circ_0056891、hsa_circ_0063425、hsa_circ_0071336 T2DM表达水平降低是2型DM的独立预测因子，且可能在T2DM及IFG的发病机制中起重要作用。

三、circ RNA与DM相关并发症

circ RNA不仅在DM及胰岛组织中起到一定作用，在DM各类并发症中也起到重要作用。

1.糖尿病肾病糖尿病肾病是DM重要的微血管并发症，是导致终末期肾病的主要原因。目前认为，表观遗传学改变是糖尿病肾病重要发病机制之一[25]，其中circ RNA的作用尚未完全明确。Wei等[26]研究者发现db/db小鼠肾组织中circRNA_15698表达水平较对照组明显升高，且在高糖刺激后肾小球系膜细胞中得到验证，circRNA_15698可通过miR-185/TGF-β1通路，下调miR-185，阻断其对TGF-β1的干扰作用，从而加重细胞外基质的沉积。范秋灵等[27]发现高糖培养HK-2细胞中hsa_circ RNA_404975表达水平较对照组显著升高，hsa_circ RNA_103142表达水平较对照组显著下降，在加入caspase-1抑制剂后上述circ RNA表达差异较对照组减小，提示circ RNA可能参与糖尿病肾病肾小管间质病变，并与炎症及焦亡机制相关。circ RNA在糖尿病肾病发病机制中的具体作用有待进一步研究证实。

2.DM相关心血管病变心血管疾病是DM的主要并发症，据统计65%的DM死亡患者的死亡原因为心血管系统疾病[28]。研究发现，circ RNA参与了DM心肌病变、血管损伤等过程。Bing等[29]通过检测db/db小鼠心肌细胞发现circRNA_010567表达水平较对照组升高，并通过调控miR-141/TGF-β1通路促进心肌细胞的纤维化，加重DM心肌病变。Chen等[30]发现高糖刺激后的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscular cells，VSMCs)中circ WDR77表达水平显著升高，并通过miR-124/FGF-2通路调控高糖环境下VSMCs的增殖和细胞迁移。Pan等[31]发现高糖刺激血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VECs)后circ RNA_0054633表达水平上调，调控下游miR-218/ROBO1和miR-218/HO-1通路介导内皮细胞功能失调。Ying等[32]发现高糖刺激人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVECs)中circHIPK3表达水平显著下调，在HUVECs中，circHIPK3是通过吸附miR-124，阻断其下调SphK1-STAT3的生物学功能，从而起到细胞保护功能，但高糖刺激下细胞内circHIPK3表达水平下调，造成miR-124聚集，SphK1-STAT3水平降低，最终导致细胞损伤甚至死亡。

3.DM视网膜病变 DM视网膜病变是DM的重要微血管并发症之一，DM视网膜病变患者的逐年增多导致全球盲人数量剧增[3]。研究发现，circ RNA同样参与了DM视网膜内皮损伤过程。Kun等[33]发现在DM情况下，人源及鼠源视网膜血管内皮细胞中，circHIPK3表达水平显著升高，并经过在体实验验证circHIPK3通过吸附miR-30a-3p上调VEGFC、FZD4、WNT2水平，介导视网膜血管内皮细胞功能失调。

4.DM周围神经病变 DM周围神经病变是较常见的DM并发症，约三分之一的DM患者患有DM周围神经病变[34]。Liang等[35]研究发现神经性疼痛的DM患者血清中含有大量circHIPK3，且circHIPK3的上调与2型DM患者的分级神经性疼痛呈正相关。动物实验研究证实，STZ诱导DM大鼠背根神经节circHIPK3水平、IL-1β、IL-6、IL-12及TNF-α等炎症因子水平及疼痛评分显著升高，而敲除circHIPK3可降低上述炎症因子水平及疼痛评分，进一步研究表明其机制可能是circHIPK3通过吸附miR-124，阻断其控制炎症和神经性疼痛功能，从而导致DM周围神经病变所致的神经型疼痛，其下游具体机制有待进一步研究证实。