足细胞上皮-间充质转分化与肾小球疾病
2020-12-14陈海云敖英朱亚男汪晖
陈海云 敖英 朱亚男 汪晖
430071 武汉,武汉大学基础医学院药理学系发育源性疾病湖北省重点实验室
足细胞是肾小球脏层上皮细胞,对于维持肾小球滤过屏障的结构和功能具有重要意义。研究表明,在一些理化因素的刺激下,足细胞会出现损伤或功能障碍,严重者出现细胞凋亡和脱落,导致肾小球硬化和肾功能损害[1]。上述损伤因素也会致使足细胞发生上皮-间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),足细胞功能蛋白Ⅰ型肾母细胞瘤(Wilms’tumor 1,WT1)、去氧肾上腺素等表达减少,并伴随蛋白尿、肾小球玻璃样变等病理现象。足细胞EMT是足细胞损伤的早期事件,且足细胞EMT在多种肾小球疾病中都扮演着重要的角色。本文将围绕足细胞EMT展开阐述,对足细胞EMT的影响因素、发生机制以及足细胞EMT与肾小球疾病的关系进行综述,拟展现足细胞EMT及其所致疾病的最新研究进展。
一、足细胞EMT
EMT是指在各种理化因素作用下,上皮细胞失去其表型特征,并获得间质细胞表型的病理生理学改变。这种细胞分化和转变由关键转录因子介导,包括蜗牛家族Snail、锌指E盒结合和碱性螺旋-环-螺旋转录因子。足细胞为不可再生细胞,附着在肾小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)外侧,与内皮细胞及其他蛋白多糖等共同构成肾小球滤过屏障。近年来的研究表明,在损伤因素作用下,足细胞会产生一系列形态学改变,并可能发生EMT。
足细胞EMT的主要表现为细胞骨架蛋白重排、足突融合和裂孔膜间隙增大;足细胞表型标志物如nephrin、podocin、P-cadherin、WT1等表达降低,间质细胞标志物如结蛋白(desmin)、成纤维细胞特异性蛋白-1(fibroblast-specific protein 1,FSP-1)、波形蛋白(vimentin)、平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)等表达上调,同时受损的足细胞从GBM上脱落使足细胞数量减少,GBM裸露,破坏肾小球滤过膜完整性,肾小球功能发生改变,产生蛋白尿,进一步发展成为肾小球硬化。已证实,EMT是足细胞损伤的早期事件,可进一步引起细胞凋亡和脱落,因而在肾小球硬化中起至关重要的作用[2]。
二、足细胞EMT的诱因
足细胞EMT是足细胞损伤的一种表现形式,也是导致多种肾小球疾病的始动因素之一。导致足细胞损伤的因素主要可分为先天因素(遗传因素)和后天因素两类。研究表明,凡是能够诱使足细胞损伤的因素都可能引起足细胞发生EMT[3]。
1.先天因素 遗传因素是影响机体生长发育的重要内因之一,它包括染色体组学、基因组学。WT1在肾脏发育过程中可促进后肾间充质干细胞经间充质-上皮细胞转化(mesenchymal-epithelial transition,MET)分化为足细胞,对足细胞的形成和成熟至关重要。报道指出[4],错义突变或足细胞条件性敲除WT1可导致人和小鼠肾小球瘢痕化。由WT1错义突变诱导的小鼠肾小球硬化模型导致足细胞紧密连接蛋白(Zonula occludens 1,ZO-1)表达降低和足细胞转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)表达上调[5],进一步可引发足细胞EMT,提示WT1可能是足细胞EMT的关键调节剂。基因的甲基化和去甲基化是一种常见的表遗传修饰形式,可参与许多生物过程。有研究指出[6],基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)启动子去甲基化可促进足细胞EMT,但其机制有待进一步研究。另有研究指出,由DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1,DNMT1)直接介导的Kruppel样因子4(kruppel-like factor 4,KLF4)的高甲基化有助于肾上皮细胞中EMT的进展[7]。由此推测,表遗传修饰异常也可能是足细胞EMT的一种诱因。
2.后天因素 除了先天因素外,足细胞发育不良、肾素-血管紧素系统(renin-angiotensin-system,RAS)、活性氧(reactive oxygen,ROS)、脂质及炎症因子等很多诱导因素也可以促进足细胞发生EMT。
足细胞作为一种终末分化细胞,其发育成熟后不具再生性,故足细胞发育异常亦可引起足细胞EMT。足细胞发育不良会引起足细胞缺失和功能障碍[8]。nephrin作为足细胞的重要功能蛋白,它的正常表达在很大程度影响足细胞的状态。胚胎时期,nephrin表达缺失是足细胞发育不良的标志之一,可导致足突和裂孔膜的形成障碍。成年个体nephrin缺失标志着足细胞上皮表型的破坏,同时也可以激活β-连环蛋白(β-catenin)信号通路诱导足细胞发生EMT,促进肾小球硬化发生。孕期不良环境暴露可引起低出生体重和早产,继而影响足细胞发育。本实验室研究发现,孕期咖啡因暴露会引起胎儿宫内发育迟缓,并引起胎肾结构与功能的损伤,足细胞标志基因nephrin表达降低,致胎儿足细胞发育不良,并导致成年子代蛋白尿和肾小球硬化碍[9]。而我们的进一步研究也发现,足细胞发育不良大鼠成年后其足细胞表型向EMT转变,如上皮细胞标志基因nephrin、WT1等表达降低,间质细胞标志基因desmin、α-SMA等的表达上调碍[10]。以上研究提示,足细胞的发育异常不仅会引起足细胞功能障碍,更可能导致足细胞EMT的发生。
Ang II的过度生成通过激活受体AT1R促进TGF-β1等细胞因子的表达,诱导系膜细胞外基质合成,并促进转录因子8(transcription factor 8,TCF8)的转录,抑制上皮基因表达进一步促进足细胞EMT[11]。ROS是足细胞损伤和慢性肾病进展的重要促进因素,可促进足细胞凋亡,ROS的增加可引起足细胞损伤和蛋白尿,继而出现肾脏炎症、肾小球硬化和间质纤维化碍[12]。Ang II可以增加足细胞中ROS的产生,从而介导F-肌动蛋白骨架重排,导致足细胞损伤甚至凋亡碍[13],证实这种ROS异常活化引起的蛋白骨架重排、TGF-β释放增加、细胞外基质合成等均会致使足细胞发生EMT。脂质代谢异常与足细胞EMT的发生也密切相关。研究表明,低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDL-R)的蛋白表达与α-SMA蛋白表达呈正相关,与nephrin蛋白表达呈负相关。脂质积累促进Ⅰ型胶原蛋白(Type 1 collagen)、α-SMA和纤维连接蛋白(Fibronectin)的表达,并降低了足细胞中nephrin的表达。这证实LDL-R途径诱导的脂质积累可诱导足细胞EMT。一系列报道显示碍[14],肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)等炎性细胞因子通过下调E-钙黏蛋白(E-cadherin)、ZO-1等上皮标志物的表达,上调α-SMA、Fibronectin等间充质标志物的表达来诱导EMT,虽然未见到其关于足细胞EMT的相关报道,但炎性细胞因子可诱导EMT是确认的。
三、介导足细胞EMT的信号通路
介导足细胞EMT的通路有许多种,现已发现的主要信号通路有TGF-β/smad、Wnt/β-catenin和Notch。这些通路既有各自的信号传导路径,又在不同层面相互连接、整合,组成错综复杂的网络,共同介导和调控足细胞EMT的过程。
1.TGF-β/Smad信号通路 转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是目前已知诱导足细胞EMT的最主要因子,也是诱导各种细胞纤维化形成的枢纽环节。TGF-β1之所以能发挥其生物功能,主要依靠以 Smad 和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)为主的信号途径。在一定刺激下,TGF-β1受体被激活后,磷酸化并激活 Smad2、Smad3,活化的Smad2、Smad3 与 Smad4 形成复合物并一同进入细胞核内,促进整合素链接激酶(integrin linked Kinase,ILK)、整合素-β1(β1-integrin)、Wnt、Snail、α-SMA和基质金属蛋白酶2(matrix metalloprotein-2,MMP-2)等转分化相关基因的表达,上调β-catenin的表达,从而促进EMT的发生。已有研究报道,β-catenin的激活可以下调上皮标志物E-cadherin和ZO-1的表达,而上调α-SMA等的表达。这证实β-catenin蛋白转导参与诱导EMT过程。TGF-β1信号通过Smad直接增加LEF1的表达,并通过磷酸肌醇3-激酶(PI3K)-Akt途径抑制糖原合酶激酶3β(GSK-3β),使β-catenin依赖性激活淋巴增强因子1(LEF-1)诱导EMT,同时也有研究证实,抑制TGF-β1的表达可以阻止肾小球硬化及纤维化的发生,减少间质细胞相关基因Ⅳ型胶原和纤黏蛋白的表达[16]。可见,TGF-β/Smad通路在介导EMT的过程中扮演了重要角色。实验证明,TGF-β/Smad通路可引起体外培养的足细胞发生EMT,且足细胞EMT的程度与TGF-β1呈剂量依赖增加,TGF-β1可通过激活PI3K/PKB信号通路,调节足细胞基质的粘附和纤维连接蛋白基质沉积,促进EMT进程[17]。
2.Wnt/β-catenin信号通路 Wnt/β-catenin信号传导途径几乎涉及胚胎发育的每个方面。Wnt(Wingless and lnt1)信号是一种跨膜信号,参与细胞的分化和运动,肾脏的发育、形态以及功能的维持均有赖于 Wnt 信号通路正常“开启”和及时“关闭”,但其在成人肾脏中的表达基本是维持不变的。Wnt 信号通路在足细胞中的激活通常与蛋白尿和肾小球硬化进展有关。β-catenin是Wnt的下游信号分子,当 Wnt 配体与卷曲受体蛋白Frizzled(Fz)受体以及低密度脂蛋白受体关联蛋白6(low density lipoprotein receptor-related protein,LRP6)或者其类似物(LRP5)相关结合时,Wnt 信号通路被激活,GSK-3β不能使β-catenin磷酸化,β-catenin 稳定游离在胞质中,聚积后转位至细胞核。核β-catenin与 T 细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)转录因子家族的成员结合以促进EMT。最新研究表明,在糖尿病肾病患者中,Wnt/β-catenin 信号通路激活,诱导 β-catenin 表达增加,从而加速足细胞 EMT碍[18],最终导致足细胞功能紊乱。
3.Notch信号通路 Notch信号通路与TGF-β/Smad信号通路存在交互作用,Notch途径为TGF-β1介导EMT进程所必需。Notch信号可以通过诱导缺氧诱导因子1a(Hypoxia-inducible factor 1a,HIF-1a)间接促进Snail1的表达,其中Snail1是转录阻遏物,在调节EMT中起关键作用。研究表明碍[19],Notch途径通过激活Snail1诱导EMT。Snail1表达的上调可以通过抑制上皮细胞标志物E-cadherin的表达,促进间质细胞标志物N-cadherin及vimentin的表达,进而使足细胞发生EMT。另外Snail2与Notch相互作用,对于Notch介导的E-cadherin的抑制和β-catenin的激活是必需的。除了由细胞内结构域介导的直接作用外,Notch还通过各种信号通路(包括NF-κB和β-catenin)以及各种调控miRNA的作用间接调控EMT碍[20]。
如前所述,3条信号通路都可以激活足细胞的EMT,且在某种程度上,β-catenin 作为一个共同的开关,使TGF-β、Notch和Wnt 信号通路在不同的层面相互连接、整合,成为调控EMT所必需的转录分子及信号媒介。
四、足细胞EMT与肾小球疾病
足细胞损伤是多种肾小球疾病的共同病理基础,包括糖尿病肾病、肾小球硬化、IgA型肾病等。EMT是足细胞损伤的早期事件,可进一步诱发多种肾小球疾病。
1.足细胞EMT与糖尿病肾病 糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最严重的并发症之一,也是全世界终末期肾病发病的主要原因,常见的临床特征为进行性蛋白尿,肾脏足细胞损伤是引起蛋白尿的关键靶点。Liu[21]认为,损伤早期的足细胞EMT是使肾小球滤过屏障受损发生蛋白尿的主要因素,终止足细胞EMT可早期防治蛋白尿的发生,缓解DN的进程。高糖可从多途径引起足细胞EMT,如叉头状转录因子O1(Forkhead transcription factor O1,FoxO1)在抗氧化应激、糖脂代谢等方面发挥重要作用。在足细胞中,FoxO1可能通过抑制TGF-β/Smad/ILK信号通路过度激活,减轻高糖诱导的足细胞EMT,从而缓解DN甚至足细胞损伤碍[22];结缔组织生长因子(CTGF)诱导的足细胞损伤可能导致DN,抑制CTGF可通过减少β-catenin的表达来预防足细胞EMT,缓解DN进程碍[23];胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)参与调节DN中足细胞的损伤,沉默IGFBP7可通过抑制TGF-β/Smad途径抑制HG介导的足细胞EMT,IGFBP7可作为DN的新型诊断和治疗靶标[24]等。
随着对分子生物学的认识越来越深入,人们发现非编码单链RNA(miRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)与DN中足细胞EMT之间关系密切。有报道称,miR-124a可通过抑制小窝蛋白-1(caveolin 1,cav-1)和β-catenin的激活来减弱DN所致的足细胞EMT[25];miR-133b和miR-199b的敲低可减轻DN中TGF-β诱导的足细胞EMT[26];lncRNA ENSRNOG00000037522的上调通过抑制nephrin等的表达增强DN中的足细胞EMT等[27]。这些研究提示,非编码RNA与足细胞EMT及DN的发生、发展关系密切,其有望成为DN防治的潜在靶标。
2.足细胞EMT与肾小球硬化症 足细胞EMT是肾小球硬化的始动因素。肾小球硬化症是一种以肾小球病变为主的临床病理综合征,其典型病理特征为肾小球玻璃样变、系膜细胞增生及细胞外基质过量沉积,临床主要表现为大量蛋白尿和肾功能进行性恶化。它是各种慢性肾小球疾病向终末期肾病进展和恶化的共同病理阶段。当肾小球受到损伤时,足细胞会发生一系列的表型改变甚至脱失。有研究指出,在多数病理生理条件下足细胞的主要反应是发生EMT[28]。最近的实验表明,足细胞在损伤后可能经历EMT,这种表型转化导致足细胞失去其特化的上皮特征并获得新的间充质标记物,这一转变无疑会损害肾小球滤过屏障的完整性,导致蛋白尿发生[29]。这种肾小球功能性异常进一步可诱发一系列肾小球疾病,最终致肾小球硬化。
3.足细胞EMT与免疫球蛋白A(IgA)肾病 IgA肾病是最为常见的一种原发性肾小球疾病,其特征在于肾小球系膜细胞中IgA的沉积。以往临床上IgA肾病主要是以系膜区IgA沉积为病理特征,研究也多集中于系膜细胞在肾小球硬化中的作用。但近几年来,足细胞病变在肾小球肾炎进展中的作用越来越受瞩目。目前的研究表明,足细胞损伤在IgA肾病的肾小球硬化中起着重要作用。IgA1是IgA肾病中公认的关键性致病因子。越来越多的报道指出,系膜区内未成熟的IgA1沉积可能是IgA肾病的致病机制[30]。IgA肾病中IgA1直接下调了足细胞标记物nephrin的mRNA表达,最终导致蛋白尿的形成。同时大量伴有蛋白尿的IgA肾病患者足细胞中表现出显著的α-SMA和FSP-1的mRNA表达增加[31]。这些结果均表明,IgA肾病患者发生足细胞EMT。
4.足细胞EMT与肾病综合征 肾病综合征可由多种病因引起,主要表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症等临床症候群。足细胞特异性基因突变可能在肾病综合征的发展中起重要作用。已证实,nephrin是足细胞的特殊功能蛋白,它的缺失会导致足细胞功能障碍性损伤,进一步导致足细胞EMT,并伴随着蛋白尿和肾病综合征的易感[32]。最早发现编码sli膜蛋白nephrin(NPHS1)和podocin(NPHS2)的基因遗传缺陷可致肾病综合征,推测足细胞EMT与肾病综合征有关,且足细胞EMT可能参与介导了肾病综合征[33]。
五、足细胞EMT的防治药物
足细胞损伤在肾小球硬化的发病机制中起核心作用。因此,靶向遏制足细胞损伤和稳定足细胞数量的疗法在一定程度上可减缓肾小球硬化的进展。目前,对足细胞EMT所致肾小球硬化的治疗手段一般采取综合治疗。现用较多的防治药物主要为新型化学类药物、传统中药制剂和分子药物。
1.化学类药物 常用的化学类药物包括免疫抑制剂、糖皮质激素类等。糖皮质激素可通过受体和非受体途径稳定细胞骨架、上调nephrin,进而保护足细胞免受损伤[34]。肝细胞生长因子(HGF)在肾脏间质细胞中表达,且与慢性肾纤维化中TGF-β1的表达呈负相关。体外和体内研究发现HGF特异性地抵消了TGF-β1的作用[35],提示HGF对肾脏的保护作用与抑制足细胞EMT有关。有实验发现,APX-115(ewha-18278)是一种新型口服Noxs抑制剂,可以保护2型糖尿病诱发的肾损伤[36],APX-115治疗的DN大鼠nephrin表达明显比患病大鼠高,且α-SMA和Ⅳ胶原的蛋白表达被抑制,表明APX-115可以逆转糖尿病足细胞损伤,改善足细胞EMT进展。
2.中药制剂类 传统中药制剂在临床上的应用也非常广泛,如雷公藤内酯醇(triptolide,TP),是从雷公藤中分离所得的一种二萜类化合物,可通过靶向转录因子、激酶或抑制泛素/蛋白酶体等机制发挥抑制细胞增殖和促肿瘤细胞凋亡等抗肿瘤作用。大量体内外研究均证实,TP具有保护足细胞、抑制蛋白尿的作用,并可通过调节Smad信号途径减轻肾脏纤维化程度[37]。TP通过有效抑制p53、p38和NFκB等信号通路,直接作用于足细胞,以减轻细胞凋亡、氧化应激等造成的损伤,从而保护足细胞。雷公藤制剂治疗糖尿病肾病已在临床上广泛应用。糖肾平为中药复方在防治DN的临床应用中显示出良好的疗效。研究发现[38],糖肾平能降低足细胞中TGF-β1、Smad2/3的表达,增加足细胞标志物CD2相关蛋白(CD2-associated protein,CD2AP)表达,减少间质细胞标志物α-SMA,这些结果表明,糖肾平通过抑制TGF-β1/Smad2/3信号通路的激活缓解足细胞EMT,维持足细胞形态功能的稳定性,进而保证肾小球滤过屏障的完整性,减少蛋白尿的发生,减轻肾脏纤维化,这可能是其防治DN的作用机制之一。
3.分子药物 随着分子生物学热潮的来临,研究者更多的认识到其在机制研究及疾病防治中的重要位置。非编码RNA,如lncRNA、miRNA参与各种生理和病理过程,最近的证据表明它们参与了上皮-间质化的过程。已知lncRNA ENSRNOG00000037522在DN足细胞EMT中起关键作用。通过小干扰RNA转染使lncRNA ENSRNOG00000037522沉默或敲低lncRNA ENSRNOG00000037522可以通过调节α-SMA、nephrin的表达来修复足细胞的损伤[27]。lncC01619在足细胞细胞质中表达,并参与内质网应激信号通路。在DN大鼠模型中lncC01619下调,并导致足细胞损伤,而过表达lncC01619可减轻DN大鼠足细胞损伤改善肾功能[39],同样miR-27a已被证实通过DN中PPARγ/β-catenin信号传导介导足细胞EMT,其在DN患者中表达上调,具有临床和生物学意义。在DN大鼠中给予miR-27a抑制剂可逆转足细胞EMT,并缓解肾功能[40]。以上研究均提示我们非编码RNA在肾病患者足细胞EMT中扮演着重要的角色,其具备临床和生物学意义,可作为足细胞EMT的潜在靶点。虽然类似的分子药物暂时并没有出现在临床上,但其在整体动物水平具有良好的干预效果,相信在不久的以后,它们将会成为最安全有效的治疗药物。
六、结语
EMT是胚胎发育和组织修复中的重要机制。EMT参与介导疾病的进展,包括器官纤维化和癌症。足细胞的损伤会使足细胞发生EMT,破坏肾小球的滤过屏障,引发蛋白尿,导致多种肾小球疾病的发生、发展。EMT是一个动态的转变过程,引发EMT的信号通路有多种,对其中任一环节进行干预都有可能会诱发新的疾病或产生新的治疗靶点,阻断足细胞EMT可能成为更好的治疗肾小球疾病的方案。寻找更早期且精准的靶点是今后要努力的方向。