干燥方式对丹参茎叶中酚酸类成分及其抗氧化活性的影响

敖青霞，姜媛媛，许 轲，丰先红，赵茂俊，张 利*

（1.四川农业大学理学院，四川雅安 625014；2.四川省园艺作物技术推广总站，四川成都 610041；3.甘孜藏族自治州农业科学研究所，四川康定 626000）

丹参Salvia miltiorrhizaBge.唇形科鼠尾草属多年生草本植物,以其干燥根和根茎入药［1-2］,是我国传统大宗药材。丹参主要有效成分为水溶性酚酸类和脂溶性丹参酮类,其中酚酸类具有较强的抗脂质过氧化和清除自由基能力,是目前已知抗氧化作用最强的天然产物之一［3］。李欣等［4］发现丹参叶中总酚酸含有量较高,且总酚酸含有量和抗氧化活性之间有很高的相关性。曾慧婷等［5］发现,丹参茎叶具有较强的抗氧化活性,其提取物中富含酚酸类成分,如丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素和咖啡酸。丹参茎叶虽富含酚酸类成分,但在实际生产过程中并未被有效利用,造成严重的资源浪费和环境污染［6-8］。

酚酸类成分性质极不稳定,对热敏感,在受热情况下极易发生分解、氧化以及脱氢羟基反应,干燥时易造成酚酸类成分损失［9］。郭辉［10］采用不同干燥方式对丹参提取液进行干燥,发现冷冻干燥对丹参提取液中酚酸含有量的影响最小。陈立军等［11］研究真空减压干燥、喷雾干燥、微波干燥和冷冻干燥对丹参中酚酸含有量的影响,发现冷冻干燥能最大程度的保留丹参中酚酸类成分。沙秀秀［12］发现不同的干燥条件对丹参茎叶中酚酸类成分含有量影响较大,其中微波杀青-热风干燥的丹参茎叶品质较优。因此,选用合适的干燥方式对丹参茎叶中酚酸类成分的保留至关重要。目前关于干燥方式对丹参茎叶中酚酸类成分含有量及其抗氧化活性的影响鲜有报道。本研究通过探讨不同干燥方式对丹参茎叶中总酚酸、丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素和咖啡酸含有量及其抗氧化活性的影响,以期筛选适合丹参茎叶的干燥方式,为丹参茎叶的合理开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 丹酚酸B （批号MUST-18070503）、迷迭香酸 （批号MUST-18053110）、丹参素 （批号MUST-13030108）、咖啡酸（批号MUST-12042403）对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司,纯度均大于98%；乙腈（色谱纯,美国J.T.Baker公司）；无水乙醇、甲醇（分析纯,成都市科隆化学品有限公司）。

1.2 材料及干燥方法 丹参茎叶于2018年8月采自四川中江,经四川农业大学生命科学学院杨瑞武教授鉴定为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的茎叶。将采集的丹参茎叶除去泥土,切成均匀小段,混匀后平均分为3份,分别进行自然阴干、真空冷冻干燥和恒温鼓风干燥,干燥至恒定质量,粉碎,过50目筛,干燥保存备用。自然阴干,将丹参茎叶置于室内通风处自然阴干；真空冷冻干燥,将经预冻处理的丹参茎叶置于真空冷冻干燥机中；恒温鼓风干燥,将丹参茎叶置于鼓风干燥箱内烘干,温度55 ℃。

1.3 丹参茎叶提取液制备 分别准确称取不同干燥方式处理的丹参茎叶粉末0.5 g,置于具塞锥形瓶中,参照翟宏宇等［13］的方法提取丹参茎叶中的酚酸类成分。提取后过滤,取1 mL滤液,甲醇稀释定容至25 mL,备用。

1.4 总酚酸含有量测定 参照文献［14］,以没食子酸为对照品,采用福林-酚比色法测定丹参茎叶中总酚酸含有量,以吸光值为纵坐标（Y）,以没食子酸浓度为横坐标（X）,进行回归。

1.5 丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素、咖啡酸含有量测定

1.5.1 分析条件 参考文献［2］,Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流动相乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）；梯度洗脱（0～15 min,90%～80% B；15～35 min,80%～75% B；35～45 min,75%～70% B；45～55 min,70%～10%B；55～70 min,10% B）；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长286 nm；进样量10 μL。

1.5.2 对照品溶液制备 分别精密称取对照品丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素和咖啡酸各5 mg,甲醇溶解后定容至 10 mL,制备成质量浓度为0.5 mg/mL的对照品贮备液。所有对照品溶液均在4 ℃条件下保存。

分别精密吸取上述丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素和咖啡酸对照品贮备液1.50、1.30、0.90、0.30 mL,甲醇定容至10 mL,摇匀,即得75 μg/mL丹酚酸B、65 μg/mL迷迭香酸、45 μg/mL丹参素、15 μg/mL咖啡酸的混合对照品溶液。

在“1.5.1” 项条件下测得丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素和咖啡酸的对照品在不同质量浓度时的峰面积,以峰面积为纵坐标（Y）,质量浓度为横坐标（X）,进行回归。

1.6 抗氧化活性测定

1.6.1 还原力 将不同干燥方式处理的丹参茎叶的提取液配成系列梯度质量浓度溶液 （0～30 μg/mL）,采用铁氰化钾还原法［15］测定丹参茎叶的还原力。平行实验3次,取其平均值。

1.6.2 DPPH自由基清除活性 将不同干燥方式处理的丹参茎叶的提取液配成系列梯度质量浓度溶液（10～300 μg/mL）,参照Wang等［16］方法,测定丹参茎叶的DPPH自由基清除活性。平行实验3次,取其平均值。按公式（1）计算：

式中,As为含样品的溶液吸光值； Ao为水代替样品的溶液吸光值。

1.6.3 超氧阴离子自由基清除活性 将不同干燥方式处理的丹参茎叶的提取液配成系列梯度质量浓度溶液（0～60 μg/mL）,参照Lu等［17］方法测定丹参茎叶的超氧阴离子自由基清除活性。平行实验3次,取其平均值。按公式（2）计算：

式中,A1为加入样品溶液的吸光值； A0为水代替样品混合溶液的吸光值； A2为未加邻苯三酚的样品溶液的吸光度。

1.7 数据统计分析 采用Microsoft excel 2010和Origin 8.5软件对数据处理,并绘制相应的图表；采用SPSS 23.0软件对测定结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 干燥方式对丹参茎叶中总酚酸含有量的影响

采用福林-酚比色法得到总酚酸的回归方程为Y=0.285 1X-0.027 （ r=0.999 8）,在 500～5 500 μg/mL范围内线性关系良好。用相同方法测定不同干燥方式处理后的丹参茎叶中总酚酸含有量。由表1可知,经自然阴干、真空冷冻干燥和恒温鼓风干燥3种干燥方式处理的丹参茎叶中总酚酸含有量分别为107.63、112.12、87.95 mg/g；真空冷冻干燥的丹参茎叶中总酚酸含有量高于自然阴干（P＜0.05）,且极显著恒温鼓风干燥（P＜0.01）。

表1 不同干燥方式处理后丹参茎叶总酚酸含有量Tab.1 Content of total phenolic acids in stems and leaves of S.miltiorrhizaafter different drying process

2.2 干燥方式对丹参茎叶中丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素和咖啡酸含有量的影响 采用HPLC法测定不同干燥方式处理后丹参茎叶中丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素和咖啡酸的含有量,结果见图1、表2～3。由表3可知,干燥方式对丹参茎叶中丹酚酸B含有量无显著影响。经3种干燥方式处理后丹参茎叶中迷迭香酸含有量存在统计学差异（P＜0.01）,真空冷冻干燥处理的丹参茎叶中迷迭香酸含有量最高（25.94 mg/g）；自然阴干次之（20.67 mg/g）；恒温鼓风干燥最低（15.06 mg/g）。真空冷冻干燥和恒温鼓风干燥对丹参茎叶中丹参素含有量无显著影响,其含有量分别为0.70、0.68 mg/g,且均高于自然阴干（P＜0.05）。真空冷冻干燥的丹参茎叶中咖啡酸含有量高于其他2种干燥方式（P＜0.01）,达到0.69 mg/g,恒温鼓风干燥（0.39 mg/g）高于自然阴干（0.36 mg/g）（P＜0.05）。

图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

表3 不同干燥方式处理后丹参茎叶中酚酸类成分含有量（mg/g）Tab.3 Contents of phenolic acids in stems and leaves of Salvia miltiorrhizaafter different drying processes（mg/g）

2.3 干燥方式对丹参茎叶抗氧化活性的影响

2.3.1 还原力 经不同干燥方式处理丹参茎叶后,测定吸光度,计算还原力,结果见图2。由结果可知,丹参茎叶的还原力与提取液的浓度呈明显的量效关系。当提取液质量浓度一致时,不同干燥方式处理的丹参茎叶的还原力大小依次为真空冷冻干燥、自然阴干、恒温鼓风干燥。

2.3.2 DPPH自由基清除能力 经不同干燥方式处理丹参茎叶后,其DPPH自由基清除结果见图3。由结果可知,经不同干燥方式处理的丹参茎叶均具有较强的清除DPPH自由基能力。由曲线拟合所得,经自然阴干、真空冷冻干燥和恒温鼓风干燥处理的丹参茎叶对DPPH自由基清除能力的IC50值分别为40、30、70 μg/mL,表明真空冷冻干燥处理的丹参茎叶清除DPPH自由基的能力最强,自然阴干次之,恒温鼓风干燥最弱。

图3 不同干燥方式处理后丹参茎叶DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH free radical scavenging capacity of S.miltiorrhizastems and leaves after different drying processes

2.3.3 超氧阴离子自由基清除作用 不同干燥方式处理丹参茎叶后其清除超氧阴离子自由基,结果见图4。由结果可知,丹参茎叶提取液浓度与超氧阴离子自由基清除率呈正相关。由曲线拟合所得,经自然阴干、真空冷冻干燥和恒温鼓风干燥处理的丹参茎叶对超氧阴离子自由基清除能力的IC50值依次为28、25、30 μg/mL。丹参茎叶清除超氧阴离子自由基能力从强到弱依次为以真空冷冻干燥、自然阴干、恒温鼓风干燥。

图4 不同干燥方式处理后丹参茎叶清除超氧阴离子自由基能力Fig.4 Scavenging capacity of superoxide anion free radicals in stems and leaves of S.miltiorrhizaafter different drying processes

3 讨论

丹参茎叶常被当做农业废弃物,但早在清代的《医方守约》 中已有记载将其捣碎合酒糟可消肿。现代研究表明丹参茎叶中含酚酸类成分,主要为丹参素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B［4-5,18］。因此,研究丹参茎叶中酚酸类成分,不仅能提高对丹参茎叶的资源化利用,还能减少环境污染。但由于酚酸类成分不稳定,在干燥过程中易受温度、氧分压等因素影响,发生氧化、分解使其含有量减少［19］。

不同干燥方式对蓝莓叶［20］、甜菊叶［21］中酚酸类成分的影响,其研究结果均表明在干燥过程中温度和氧分压越低,越能有效的保留酚酸类成分。本研究发现真空冷冻干燥后丹参茎叶中总酚酸、迷迭香酸、丹参素和咖啡酸含有量均最高。可能是由于真空冷冻干燥是在低温、真空状态下,低温使丹参茎叶中的酶失活,最大程度减少丹参茎叶中酚酸类成分的降解和酶促反应,能较好的保存丹参茎叶中该类成分［20］。而恒温鼓风干燥后丹参茎叶中总酚酸和迷迭香酸含有量均最低,但丹参素和咖啡酸含有量却比自然阴干的丹参茎叶中高,可能是由于受热条件下酚酸类成分可自身降解［22］,导致丹参茎叶中其含有量减少。已有研究表明迷迭香酸可由咖啡酸和丹参素等小分子酚酸聚合形成,而迷迭香酸也可分解为小分子酚酸［14,23］。因此,推测在恒温鼓风干燥时可能由于温度较高致使迷迭香酸分解为咖啡酸和丹参素或其他小分子酚酸,使得恒温鼓风干燥的丹参茎叶中咖啡酸和丹参素含有量高于自然阴干的丹参茎叶。

本研究发现经不同干燥方式处理后丹参茎叶抗氧化活性强弱存在一定差异,可能是因不同干燥方式对丹参茎叶中酚酸类成分的影响不同。大量研究结果表明,抗氧化活性与酚酸类成分含有量之间存在相关性［24-26］。如蓝莓叶［20］和金银花［22］提取物中酚酸类成分含有量反应了其抗氧化活性的强弱,且经真空冷冻干燥后蓝莓叶和金银花中酚酸类成分含有量最高,抗氧化活性也最强。本研究发现经真空冷冻干燥后丹参茎叶的还原力、DPPH自由基清除能力和超氧阴离子清除能力均最强,迷迭香酸、丹参素和咖啡酸含有量均最高。恒温鼓风干燥处理与自然阴干处理相比,丹参茎叶中迷迭香酸含有量较低,丹参素和咖啡酸含有量均较高,但其抗氧化活性低于自然阴干,因此,可推测丹参茎叶的抗氧化活性与迷迭香酸含有量成正相关。本研究发现,不同干燥方式对丹参茎叶中迷迭香酸含有量与抗氧化活性的影响趋势基本一致。因此,推测丹参茎叶发挥抗氧化活性的物质基础主要为迷迭香酸。

4 结论

干燥方式对丹参茎叶中总酚酸、迷迭香酸、丹参素和咖啡酸含有量有一定影响,对丹酚酸B含有量无显著影响。总酚酸、迷迭香酸、丹参素和咖啡酸含有量均以真空冷冻干燥后的丹参茎叶中最高。干燥方式对丹参茎叶抗氧化活性的影响由大到小依次为真空冷冻干燥、自然阴干、恒温鼓风干燥。综上所述,真空冷冻干燥为最适合丹参茎叶的干燥方式。