脑小血管平滑肌细胞表型标志及血管细胞外基质在肾性高血压大鼠中的改变

刘 娜 薛 扬 唐 杰 张苗怡 任 雪 付建辉

（复旦大学附属华山医院神经内科 上海 200040）

脑小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）导致了全球25% 的卒中及45% 的痴呆病例，严重增加社会医疗负担［1］。散发性CSVD 的主要危险因素为年龄及高血压［2］。因此，目前CSVD动物模型主要基于高血压动物模型。以血管壁增厚、内径减小为特征的小血管重构是CSVD 最重要的病理表现，而血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）在血管重构中起重要作用。VSMCs 是一种可塑性极强的细胞，具有收缩型及合成型两种表型［3］。在生理状态下，VSMCs 表现为收缩表型，维持血管正常收缩舒张功能。然而在病理状态下（包括血管受损，高血压），VSMCs 可由收缩型转换为合成型，表现为细胞合成、分泌功能旺盛，血管壁基质因而增加，导致血管重构发生。VSMCs收缩型标志包括α-平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，αSMA），平滑肌22α 蛋白（smooth muscle 22 alpha，SM22α）等［4-5］。细丝蛋白a（filamin a，FLNa）是一种重要的细胞骨架蛋白［6］，有研究发现FLNa 的增加提示平滑肌细胞由收缩型向合成型转换［7-9］。目前，大血管疾病的研究提示VSMCs 从收缩型转换为合成型在高血压导致的大血管重构中起重要作用［10］。然而，在CSVD 的研究中，脑小动脉管壁VSMCs 表型变化的研究仍然较少。

本文拟采用易卒中型肾血管性高血压大鼠模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat，RHRsp）对CSVD 病程中脑小血管管壁VSMCs 表型标志的改变进行研究。RHRsp 是由国内学者主创的一种通过双肾双夹手术产生稳定的高血压表型的动物模型［11］。RHRsp 表现脑小血管管壁增厚、内径减小等血管重构表型，是一种相对理想的CSVD 动物模型。同时，小静脉病变也是CSVD 的重要病理表现之一，虽然早在1995 年Moody 等［12］就曾报道脑静脉血管壁基质的沉积，提出“脑室周围静脉胶原病”一词。但对于脑小静脉病变与高血压的关系目前研究仍然较少。因此本研究同时也观察RHRsp 在高血压下脑小静脉的重构表现。

材料和方法

实验动物12 只雄性SD 大鼠（70～90 g）购自北京维通利华实验动物公司，随机均分为RHRsp 组及假手术组，所有动物均饲养于复旦大学附属华山医院神经病学研究所。

RHRsp 模型制作对RHRsp 组大鼠使用U 型银夹缩窄双侧肾动脉［11］，假手术组（正常对照组）行相同开腹及分离肾动脉操作但不钳夹肾动脉。术后8 周，使用尾动脉血压计测定大鼠收缩压。

脑组织取材及冰冻切片制作两组大鼠均正常饲养至术后7 个月。实验终点，以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，经等渗盐水、4%多聚甲醛依次心脏灌流后，取脑组织继续后固定于4%多聚甲醛中4～6 h。随后进行梯度蔗糖脱水，OCT 包埋，制作10 μm 冰冻切片。切片选择层面为前囟前3.0 mm（前囟+3.0 mm）、前囟后0.24 mm（前囟-0.24 mm）及前囟后3.0 mm（前囟-3.0 mm）。

脑组织冰冻切片免疫荧光取冰冻切片室温复温后，使用0.25% 的聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）破膜15 min。5%的山羊血清（武汉博士德生物工程有限公司）室温封闭1 h 后一抗4 ℃孵育过夜。使用一抗包括：抗αSMA 抗体（美国Sigma-Aldrich 公司），抗FLNa 抗体（上海碧云天生物技术有限公司），抗SM22α 抗体，抗Ⅳ型胶原蛋白（collagen Ⅳ，COL4）抗体，抗层粘连蛋白抗体（laminin，LN）均购自英国Abcam 公司。随后对应二抗（Alexa Fluor cy3 二抗及488-conjugated 二抗，1∶1 000，美国Invitrogen Carlsbad 公司）室温孵育1 h。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染核封片，荧光显微镜下观察拍片。每只大鼠选取3 张不同层面脑组织切片，每个层面在皮层、基底节、海马、丘脑等不同脑区随机拍摄至少3 个视野。拍摄选取10×物镜，同一观察指标在同一曝光时间、背景校正参数下进行拍摄，拍摄图像分辨率为1 600×1 200。选取内径为10～65 μm 的脑小血管进行分析，有连续的αSMA 表达的血管视为小动脉，否则为小静脉。使用Image J（V1.8.0）软件在图像中选择目标血管，并获取目标血管各参数的荧光值进行统计分析。

统计学分析应用SPSS 24.0 软件处理数据，正态分布的计量资料以表示。各组数据进行方差齐性检验后，方差齐的两组采用t检验，方差不齐的两组行Welch’st检验进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

血压测量结果双肾双夹术后2 个月测量大鼠尾动脉收缩压，RHRsp 组血压显著高于假手术组［（196.5±9.07）mmHgvs.（121.3±8.19）mmHg，t=15.06，P＜0.000 1，图1，1 mmHg=0.133 kPa，下同］。实验终点前，双肾双夹术后7 个月重新测量大鼠尾动脉血压，RHRsp 组血压仍然维持较高水平［（206.3±7.6）mmHgvs.（122.5±3.94）mmHg，t=23.99，P＜0.000 1，图1］。

图1 大鼠尾动脉收缩压Fig 1 Systolic blood pressure of rats

脑小动脉血管壁平滑肌细胞表型标志表达情况与假手术组大鼠相比，RHRsp 大鼠脑小动脉平滑肌细胞收缩型标志αSMA、SM22α 表达均显著增高。同时RHRsp 大鼠脑小动脉平滑肌细胞合成型标志FLNa 亦显著高于假手术组（表1、图2）。

图2 大鼠脑小动脉平滑肌细胞表型标志表达情况Fig 2 Phenotypic markers of the smooth muscle cells in cerebral small arteries of rats

表1 大鼠脑小动脉平滑肌细胞表型标志表达情况Tab 1 The expression of phenotypic markers of the smooth muscle cells in cerebral small arteries of rats （）

表1 大鼠脑小动脉平滑肌细胞表型标志表达情况Tab 1 The expression of phenotypic markers of the smooth muscle cells in cerebral small arteries of rats （）

RHRsp：Stroke-prone renovascular hypertensive rat；SD：Sprague Dawley rat；αSMA：α smooth muscle actin；SM22α，smooth muscle 22 alpha；FLNa：Filamin a.

脑小动脉血管壁LN 及COL4 表达情况细胞外基质是血管壁结构和功能完整性的重要组成部分。其中COL4 以及LN 是血管壁细胞外基质的两大重要组成成分。VSMCs 是参与分泌血管壁细胞外基质的重要细胞。我们发现，与假手术组大鼠相比，RHRsp 大鼠脑小动脉血管壁细胞外基质LN 及COL4 表达均增高，差异有统计学意义（表2、图3、4）。

脑小静脉血管壁LN 及COL4 表达情况根据既往研究报道［13］，我们将直径在10～60 μm，没有连续αSMA 表达的小血管视为小静脉。与假手术组大鼠相比，RHRsp 大鼠脑小静脉血管壁LN 及COL4 表达均显著增高（表2、图3、4）。

表2 大鼠脑小动脉及脑小静脉血管壁基质表达情况Tab 2 The expression of vessel wall extracellular matrix in cerebral small arteries and venules of rats（）

表2 大鼠脑小动脉及脑小静脉血管壁基质表达情况Tab 2 The expression of vessel wall extracellular matrix in cerebral small arteries and venules of rats（）

RHRsp：Stroke-prone renovascular hypertensive rat；SD：Sprague Dawley rat；COL4：Collagen Ⅳ；LN：Laminin.

讨论

本研究中，RHRsp 大鼠在双肾双夹术后2 个月开始表现稳定的高血压，术后7 个月的病理检测发现RHRsp 大鼠脑小动脉VSMCs 收缩型标志及合成型标志均显著增加，同时大鼠脑小动脉及小静脉血管壁基质均显著增加，表现出管壁增厚，内径减小的脑小血管病血管重构表现。

图4 大鼠脑小动脉及脑小静脉血管壁LN 表达情况Fig 4 The expression of laminin in cerebral small arteries and venules of rats

高血压是CSVD 的重要危险因素，高血压大鼠模型被广泛应用于CSVD 的动物研究。RHRsp 模型建模成功后大鼠可表现长时间持续的高血压，适合用于观察长期慢性高血压对靶器官的损害［11］。研究报道RHRsp 表现脑小血管管壁增粗，内径减小等CSVD 病理特征［13］，同样在本研究中也发现相似表现，是良好的CSVD 动物模型。

在疾病早期，血管重构可以视为机体对抗病理状态的代偿反应，但持续的血管重构将导致血管正常功能的丧失，进而表现为失代偿。VSMCs 在血管重构中起重要作用。高血压状态下，剪切力、环形张力等血流动力学的改变可引起VSMCs 的表型发生改变。既往研究提示5 月龄自发性高血压大鼠［14］以及术后6 个月的RHRsp［13］脑小动脉VSMCs收缩型标志αSMA 表达增加。而本研究发现，双肾双夹术后7 个月的RHRsp 大鼠脑小动脉VSMCs 不仅αSMA 表达上升，其另一重要收缩型标志SM22α表达也显著增高。SM22α 仅在收缩型VSMCs 中高表达，参与VSMCs 表型转换中丝状肌动蛋白的聚合过程，具有高度特异性［15］。与之相反的是，肺动脉高压疾病中肺小动脉平滑肌细胞收缩型表型标志下降［16］，同时在自发性高血压大鼠中肠系膜小动脉也存在αSMA 表达下降［17］。我们猜测实验结果的不同可能是由于不同组织血管床的特异性或疾病进程的不同导致的。同时，本研究也发现，术后7个月的RHRsp 大鼠中脑小动脉VSMCs 中的FLNa表达上升。FLNa 是一种在平滑肌细胞丰富表达的细胞骨架蛋白［6］，有研究提示FLNa 在合成型VSMCs 中表达增加［8-9］，同时抑制FLNa 表达可以阻碍VSMCs 向合成型转换［7］。这些都提示VSMCs中的FLNa 表达上升指示VSMCs 从收缩型向合成型转换。我们的研究进一步确认了术后7 个月的RHRsp 大鼠中脑小动脉血管壁基质LN 及COL4 表达均显著增加，提示平滑肌细胞合成、分泌细胞外基质的功能旺盛。因此，我们猜测，在双肾双夹术后7 个月，RHRsp 大鼠脑小动脉平滑肌细胞处于活跃增殖及分泌状态，导致血管壁厚增粗、内径减小。CSVD 患者的尸检研究提示CSVD 终末期病理改变为血管平滑肌的瓦解及血管壁基质的增生［18］。事实上，目前大部分的动物模型病理研究均能发现脑小血管的管壁基质增生，但平滑肌瓦解仍然较少见，提示后续研究可能需要进一步优化动物模型。

此外，本研究进一步证实，在高血压动物模型中，脑小动脉血管重构同时脑小静脉也出现显著血管壁基质增生。既往研究也提示，术后6 个月的RHRsp 表现脑小静脉管壁胶原沉积增加［13］，本研究也证实，高血压大鼠脑小静脉管壁不仅胶原类型的基质沉积增加，其他管壁基质例如LN 也沉积增加。事实上，我们的早期研究亦提示自发性高血压大鼠也存在脑小静脉重构的表现［19］，高血压作为危险因素与脑小静脉管壁重构的关系及其中的机制仍需进一步研究，缺氧及低灌注后的氧化应激可能是重要因素［13，20］。目前已有研究提示，白质静脉病变影响静脉血回流可能在皮质下微梗死中起重要作用［21］。因此后续针对CSVD 的研究应该对于脑小静脉的病变给予同样的重视。