缺氧诱导因子在膝关节骨性关节炎发病机制中作用研究

廖太阳，王培民，茆 军，丁 亮，梅 伟，张 力，李晓辰，吴 鹏，徐 波，张皞晟

膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis, KOA)属于痹症范畴，包括“痛痹”、“膝痹”和“骨痹”等，主要病理特征为滑膜炎症、软骨破坏、软骨下骨病变，造成长期慢性疼痛，最终可导致膝关节活动受限甚至残疾不得不行关节置换，给工作和生活造成严重影响[1]。目前，KOA的发病机制尚未明确，一项针对KOA的非手术指南中指出，其发病可能与生物力学改变，基质金属蛋白酶(MPP)激活活化，炎症因子分泌，软骨、软骨下骨和滑膜病变等相关，提出五级治疗和干预方案[2]。关节软骨内无血管和神经组织，营养和氧气必须从滑液和软骨下骨扩散获得，故探究缺氧对人关节软骨的机制及作用就显得十分重要。近些年来，膝关节腔内缺氧及缺氧诱导因子(HIF)的作用受到广泛关注，其中HIF-1在软骨组织中具有关键作用，是维持骨关节炎软骨稳态的重要因素。本文就HIF在KOA发病机制中作用综述如下。

1 HIF信号通路

1.1HIF概述 HIF是由两个不同亚基聚合成的异源蛋白二聚体：不稳定缺氧调节的α亚基(HIF-α，分子量120 kD)和稳定氧不敏感的β亚基(HIF-β,分子量91～94 kD)，HIF-β也被称为芳香烃受体核转运体(ARNT)[3]。到目前为止，已经描述了人类HIF-α蛋白家族的3个成员：HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α。HIF-1α在缺氧的关节软骨中起重要作用，对维持关节软骨基质有保护作用，HIF-2α对关节软骨有不良影响(软骨破坏及软骨细胞死亡)，HIF-3α可能是HIF-1α和HIF-2α的靶基因，起负调控作用[4]。

1.2HIF调节机制 HIF-α蛋白表达和活性水平在常氧和缺氧状态下有所不同，正常氧浓度下极难检测到HIF-1α表达，而低氧(氧浓度为5%)时，HIF-1α可在细胞中检测到较高蛋白表达水平，在常氧(氧浓度为21%)和中度高氧(氧浓度为30%)HIF-1α蛋白表达较少甚至无表达[5]。脯氨酸羟基酶(PHD)和天冬氨酸羟基化酶(FIH)在对 HIF-α的调节中发挥了至关重要的作用。FIH是HIF-α的抑制因子，它通过特异性地对HIF-1α亚基 C-末端反式激活结构域(TAD-C) 第803位天冬酰胺残基(Asn)羟基化，从而干扰HIF-1α与其转录辅助激活因子p300/CBP的结合。在常氧条件下，HIF-α(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)在富含丝氨酸(Ser)-脯氨酸(Pro)-苏氨酸(Thr)的氧依赖降解结构域(ODDD)中发生不同程度的羟基化，其中HIF-α两个处在关键位置的蛋白被PHD进行羟基化修饰，接着被肿瘤抑制因子(VHL)所识别和结合，然后通过泛素化通路，最终 HIF-α经蛋白酶体途径被降解[6-8]。在缺氧条件下，PHD和FIH活力均下降，HIF泛素化羟基化过程受阻，蛋白酶体信号通路被抑制，在细胞质内降解受阻而稳定性和活性增加，HIF-α大量聚集、积累并活化，从胞浆进入胞核内并与结构化结构亚基 HIF-1β及转录辅助激活因子p300/CBP发生聚合形成异二聚体[9]，然后分别与各自靶基因启动子区域上的缺氧应答元件(HRE)结合，最终引发下游有关基因激活和转录[6,10]。

此外，HIF-α的蛋白水平及转录活性还受到许多炎性和生长因子表达的影响，如白细胞介素(IL)-1β、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF)-α[11]。现如今有研究表明，通过招募转录共激活因子(作用为促进基因表达)，HIF调节不同过程的基因表达，这些基因表达后参与了细胞的生长、增殖、迁移和凋亡，还有血管生成，糖的能量代谢，核苷氨基酸代谢等，使机体和组织适应缺氧，维持内环境稳态[12]。

2 缺氧对KOA发病机制影响

2.1缺氧与滑膜炎症 滑膜炎症是骨性关节炎的特征，现在已经被广泛接受，并且骨性关节炎的发生和发展与炎症反应密切相关，甚至在疾病的早期滑膜病变就先一步显现[13]。此外，在骨性关节炎患者的滑膜液中可检测到IL、干扰素(IFN)、CXC基序配体趋化因子(CXCL)、生长因子、炎性细胞因子和其他炎性介质[14]。研究表明，HIF 是骨性关节炎滑膜炎症的重要影响因素，骨性关节炎患者滑膜液中的HIF-1α浓度升高，且滑膜液和软骨中HIF-1α的水平与疾病的严重程度和关节损伤密切相关[15]。

滑膜组织分泌产生了大量的关节滑液，滑膜积液是关节滑膜炎的特征之一，滑膜组织发生病变也常常影响到正常关节软骨功能。在患者关节内常发现滑膜组织的增生、纤维化和血管形成，因为滑膜内血管生成的速度比滑膜增生的速度要慢，使滑膜氧供不足，滑膜液中氧分压降低，软骨可获得的氧减少，关节腔内缺氧严重，这一系列改变对细胞外基质的新陈代谢造成不利影响。有学者通过HIF-1α基因敲除等技术证明抑制HIF-1α和糖酵解会诱导人滑膜成纤维细胞凋亡，HIF-1α沉默则降低体内滑膜活力[16]。段鑫[17]取人骨关节炎滑膜组织进行HE、免疫组织化学、CD34染色及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等，结果表明骨性关节炎患者滑膜中HIF-1α及VEGF表达显著升高，关节在发生退变、炎症及创伤等应激损害情况下,滑膜组织均发现HIF-1α表达增高且与VEGF有显著相关性,推出HIF-1α在骨性关节炎滑膜炎中具有促进滑膜增生、繁殖和血管增生的作用。向静[18]对兔左膝关节伸直位石膏固定进行KOA造模，观察滑膜病理切片并进行免疫组织化学检查等，发现HIF-1α和 VEGF 在滑膜中表达升高，且与 KOA 的严重程度呈正相关，VEGF在 KOA 的发生和发展中受 HIF-1α的调控。有研究指出，KOA中滑膜组织处于缺氧状态并引起HIF-1α升高，升高的HIF-1α诱导成纤维样滑膜细胞焦亡,成纤维样滑膜细胞焦亡会加剧滑膜纤维化的病程进展，将滑膜组织HIF变化与焦亡纤维化联系起来，为进一步探究骨关节炎滑膜与缺氧的机制开拓了思维[19-20]。

有趣的是目前HIF在KOA滑膜的研究较少，HIF在骨性关节炎的研究有待于进一步深入挖掘。我们知道HIF-1α与HIF-2α结构相似，作用不同，二者似乎是互相拮抗共同维持膝关节缺氧环境。HIF-1α在骨性关节炎滑膜深一层表达，而HIF-2α则在衬里表层高表达，二者的作用机制与位置深浅是否存在关联？另外，笔者发现目前国内对于骨性关节炎滑膜HIF-1α变化仍停留在与VEGF及MMP关系的简单研究，其分子作用机制仍需进一步探究，而关于HIF-2α在骨关节炎滑膜病变的研究似乎有待完善，其是否可以作为针对KOA治疗的新靶点仍未可知，如HIF-2α是否可以介导骨性关节炎炎性因子释放，导致滑膜的增生，与HIF-1α协同在KOA通过何种方式起怎样的作用？

2.2缺氧与软骨破坏 软骨破坏是KOA严重的病理改变，最终结果将造成关节受损导致残疾。关节软骨由一种细胞类型的软骨细胞组成，是一种无神经血管的结缔组织，并被包裹在细胞外基质(ECM)中，这些特定的细胞约占软骨总体积的1%，并负责基质的组成和完整性，从而赋予软骨机械支持和关节润滑的功能[21]。软骨ECM是由水、Ⅱ型胶原蛋白(大部分)、蛋白聚糖(PG)和部分亲水性大分子组成。由于关节软骨没有血管，故必须依靠从关节表面扩散来进行营养和代谢物交换。因此，细胞的整个新陈代谢都适合在低氧张力下运行。骨性关节炎发病机制中的软骨破坏不仅与ECM的丧失有关，而且与软骨细胞的死亡有关。

Coimbra等[22]通过免疫印迹和Northern杂交等技术第1次证明了HIF-1α和 HIF-2α在人膝关节软骨中的表达，检测正常人和KOA膝关节软骨的软骨细胞，结果发现HIF-1α在常氧(氧浓度21%)下培养的正常人和KOA关节软骨细胞中表达,低氧条件下(氧浓度1%)培养的正常人和KOA关节软骨细胞中观察到 HIF-1α表达增加。Yang等[23]和Zhu等[24]表明缺氧条件增强了细胞HIF-1α的表达和活性。Kovács等[25]指出缺氧在软骨细胞中起着双重作用，它主要激活HIF-1α，从而促进基质合成，使RunX2(一种相关转录因子)和Wnt沉默。但是，在存在促炎性细胞因子的情况下，低氧条件会开启HIF-2α，从而增强VEGF、MMP-13和异常胶原蛋白的表达，并引起ECM的降解。

HIF-1α通过调节低氧前软骨细胞中SOX9的表达来调节软骨的形成[26]。在软骨组织工程中，HIF-1α也显示出其软骨形成能力；过表达的HIF-1α即使不使用外源性生长因子，也能促进和维持人软骨细胞表型[27]。除此之外，骨性关节炎患者因软骨基质破坏导致软骨损伤，HIF参与了这一病理过程。有学者指出HIF-1α代谢控制软骨细胞中胶原蛋白的合成和修饰，维持无氧糖酵解，使软骨基质更耐蛋白酶介导的降解，从而增加了骨量，而HIF-1α信号传导延长会干扰细胞的生物能和生物合成，从而导致骨骼发育异常[28]。Yudoh等[29]经检测常氧和低氧培养下软骨细胞上清液中糖胺聚糖(GAG)值分析测试HIF-1α介导的改变是否影响软骨细胞中产生基质蛋白的潜力，发现在缺氧条件下，HIF-1α缺乏的软骨细胞中的GAG水平降低至对照水平的35%，在反义寡核苷酸(ODN)处理组中，培养的软骨细胞在低氧条件下产生的GAG量高于在常氧条件下。此外，他还发现HIF-1α缺乏的软骨细胞显示出游离三磷腺苷和糖酵解活性均降低，最后得出HIF-1α活性对于缺氧条件下骨性关节炎软骨细胞的糖酵解、能量生成、软骨基质蛋白合成以及细胞存活的调节至关重要。

HIF-1α是缺氧软骨细胞重要的转录调节因子[30]，有促进软骨细胞分化、存活及增殖的作用。程静波和冯明利[31]研究表明，低氧状态诱导HIF-1α表达，进而促进软骨细胞的自噬。另有研究发现缺氧维持软骨细胞表型，这与HIF-1α激活Yes相关蛋白(YAP)有关，HIF-1α/YAP信号轴可能在控制生长板软骨细胞分化和维持生长板软骨细胞中软骨形成表型中起重要作用[26]。在生长板中，HIF-1α可以激活血管内皮生长因子非依赖性细胞自主机制，通过降低耗氧量维持缺氧软骨中的氧水平[32]。而HIF-2α在滑膜炎和软骨破坏过程中过表达，并且它通过调节各种分解代谢因子(例如MMP)和炎性介质的表达水平，在骨性关节炎中起着重要的分解代谢调节剂的作用。HIF-2α通过激活β-连环蛋白和核因子κB(NF-κB)信号通路介导软骨破坏和软骨细胞的死亡，可以加速骨性关节炎的进程[33]。为了控制软骨的降解，HIF-2α可以直接增强启动子活性，或通过与HIF-1α协同合作间接上调基质降解酶(如MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-12和MMP-13)的表达，HIF-2α还调节其他各种分解代谢因子的表达，例如X型胶原、VEGF、一氧化氮合酶(NOS)-2和前列腺素-过氧化物合酶2(PTGS2)，从而导致软骨破坏[34]。因此，HIF-1α在缺氧条件下对软骨形成、软骨基质蛋白合成及软骨细胞存活等方面发挥了重要作用，而HIF-2α在软骨破坏及软骨细胞死亡方面起着重要作用。

2.3缺氧与血管生成 VEGF是一种能有效促进血管再生的生长因子，VEGF通路被广泛认为在细胞生命活动(增殖、迁徙、成熟和存活)中具有重要作用[35-36]。Saetan等[37]从KOA 80例血浆和滑膜样本中发现了VEGF的过度表达，其表达水平与KOA的严重程度呈正相关，并可用于监测KOA的严重程度。

缺氧环境可诱导促红细胞生成素(EPO)，EPO首先诱导HIF-1的表达，HIF-1α促进了VEGF的表达，EPO和VEGF促进血管生成以适应缺氧环境并恢复氧含量[38]。此外，通过抑制蛋白酶体信号通路，HIF-1α没有被降解而获得稳定，得以进入细胞核内与 VEGF 基因启动子上的HRE结合，最后启动 VEGF的转录和表达[39]。在一项针对骨性关节炎VEGF和 HIF的机制研究中发现，结缔组织生长因子(CTGF)激活PI3K、AKT、ERK和NF-κB/ELK1通路上调miR-210表达并有助于抑制GPD1L表达和PHD2活性，并促进人骨性关节炎滑膜成纤维细胞中HIF-1α依赖性VEGF表达和血管生成[40]。Li等[41]发现成骨细胞中异常的甲状腺激素受体(THRα)信号传导是软骨下骨血管生成的潜在机制。在另一项研究中，通过评估HIF-2α和VEGF与原发性KOA X线检查严重程度关系，发现在骨性关节炎软骨中，HIF-2α与VEGF mRNA和蛋白水平呈显著正相关[42]。除此之外，Pufe等[43]发现在机械应力下骨性关节炎软骨细胞通过HIF-1α途径以自分泌或旁分泌方式增加 VEGF的表达。以上表明骨性关节炎软骨在缺氧和机械压力等多重因素的影响下，HIF-1α和HIF-2α对骨性关节炎中VEGF 的高表达具有重要意义。在滑膜炎症中，HIF-1α和HIF-2α调控许多炎性和生长因子的表达，如CXCL-8和CXCL-20、NOS、VEGF、基质细胞衍生因子(SDF)-1[44]。近些年来，HIF和VEGF之间的研究越来越深入，特别是在分子基因水平和信号机制方面，并与其他有关因素联系起来，说明对于这些问题的探究正在受到重视，但是仍然需要更多进一步的研究，这一切有望为建立一种新的特异性治疗方式开辟途径。

3 潜在治疗作用

目前临床已知的是缺氧和 HIF参与了KOA中软骨的破坏、滑膜的炎症和血管的生成等一系列病理生理过程，提示HIF可能是KOA潜在和重要的治疗靶点。肿瘤在缺氧方面的研究较多且较为深入，包括应用缺氧激活前药(HAP)、针对HIF特异性抑制剂或某些基因治疗，其中几种已进入临床试验[45]。这些治疗方法大多以低氧为靶向通过运输治疗性物质到某些特定的部位，但是由于缺氧不仅是一个双向双面的病理状态，也是正常生理状况下的一个动态化过程，所以这种治疗方式可能会带来某些意想不到的不良反应和伤害。在一项临床随机Ⅱ期研究中发现，TH-302作为一种缺氧激活前药最常见的不良反应包括疲劳、恶心、水肿、皮肤和黏膜毒性，以及骨髓抑制[46]。虽然在肿瘤和其他有关疾病中，这些药物的临床应用取得了初步的效果，但是HIF通路在KOA的机制和功能仍未完全阐明，以及服用这些药物带来的不良反应和药代动力学问题，使得骨性关节炎中这些抑制剂真正应用于临床仍有一段距离，仍需要继续进行相关临床试验以评估其安全和有效性[47]。

综上所述，KOA与HIF-1α和HIF-2α密切相关，HIF参与了KOA中软骨的破坏、滑膜的炎症及血管的生成等一系列病理生理过程。HIF-1α在缺氧的关节软骨中起重要作用，对维持关节软骨基质有保护作用，HIF-2α对关节软骨(软骨破坏及软骨细胞死亡)有不良影响，HIF-3α可能是HIF-1α和HIF-2α的靶基因，起负调控的作用。但与此同时，仍然存在许多问题亟须解决，需要进一步研究HIF-1在骨性关节炎发病机制中的具体作用，研究其功能及表达差异，还需与 HIF-2α等因子联合研究，并研究其与其他信号通路的交互作用。研究方面除了细胞层面的观察，还需要多在动物体内进行研究，毕竟机体对低氧的调节是一个动态变化的过程，这为干预疾病的进展打下基础，为延缓关节软骨的退变提供可能。另外，现关于缺氧在滑膜和软骨下骨方面的研究较少，滑膜病变与纤维化似乎密切相关，未来仍需要对缺氧在KOA发病机制中的作用进行更深入的研究，以期使HIF成为KOA治疗的新靶点，在早期预测和关节破坏监测方面发挥更多作用。