节律基因CRY在肿瘤中的研究进展

杜胜奇,钟江利,李福青，王 红

生物钟由视交叉上核在内的中央时钟和肝脏、胰腺、肌肉、心脏和脂肪组织等外围时钟组成[1]。生物钟代表古老的计时机制，通过眼睛对光线强度的感知，中央时钟及外围时钟协同规范人类的作息、饮食和生殖等生理节奏，而生物钟紊乱已被广泛证明与肿瘤相关[2-4]。生物钟的维持还需要节律基因的调节，CRY基因作为核心节律基因之一，在植物光解酶结构研究中首次被发现。虽然动物体内部分CRY蛋白已经失去了感光能力，却是转录调控因子和细胞内信号级联的参与者，这些级联反应控制着昼夜节律、新陈代谢和DNA损伤反应等，CRY基因异常与肿瘤的发生、发展密切相关[5]。本文对节律基因CRY在肿瘤中的研究进展进行综述如下。

1 节律基因概述

分子水平上，生物钟的维持依赖于节律基因的转录翻译正负反馈调节，目前发现的节律基因有CRY1、CRY2、PER1、PER2、PER3、CLOCK、BMAL1，NPAS2、CKIε、Tim、NR1D1、NR1D2、RORα、RORβ及RORγ等。由CLOCK、BMAL1正调控基因及CRYs、PERs负调控基因构成了最主要的反馈调节回路。 CLOCK/BMAL1二聚体正调控CRYs和PERs基因表达，于细胞质中形成CRYs/PERs蛋白复合物,积累到一定程度后进入细胞核，负调控CLOCK/BMAL1二聚体表达，随后CRYs/PERs复合物降解解除了对CLOCK/BMAL1二聚体的抑制，促进了新的循环。这一循环周期为24 h，构成了人体最基本的昼夜节律[6]。CRYs基因参与的负反馈调节系统对维持昼夜节律是至关重要的，且比PERs基因具有更重要的地位[7]。

2 CRY基因抑癌作用

癌症基因组图谱数据库分析发现CRY基因在多种恶性肿瘤组织中呈低表达[8]，表明CRY基因可能存在肿瘤抑制作用，但作用机制却鲜有报道。FBXL3(F-box/leucine-rich repeat protein 3)是SCF (SKP1-CUL1-F-box-protein)E3泛素连接酶复合物的组成部分，CRY1或CRY2作为SCFFBXL3的辅助因子提供了潜在的底物资源，参与了多种蛋白的泛素化及降解，包括c-MYC蛋白、 TLK2(tousled-like kinase 2)蛋白等，CRY1基因缺陷和(或)CRY2表达减少提高了TLK2蛋白丰度，CRY2表达减少使c-MYC蛋白整体水平升高[9-10]。TLK2的扩增和过表达机械性的损害由CHK1/2参与的DNA损伤检查点信号，导致G2/M检查点缺陷，DNA修复过程延迟，染色体不稳定性升高[11]，而c-MYC是最常见的致癌基因之一，调控包括细胞生长周期、核糖体生物合成和代谢在内的生理过程，c-MYC蛋白表达增加与多种原发性癌症相关[12]。可见，CRY基因在DNA损伤修复、细胞周期调控及组织代谢中起到重要作用，而CRY基因是否还存在其他抑癌机制需要更多的研究来发现。

3 CRY基因表达与肿瘤相关性

3.1CRY基因与结直肠癌 糖酵解对肿瘤细胞的增殖和侵袭至关重要，即使存在充足的氧气，癌细胞也会表现出高水平的糖酵解。Guo等[13]提出在结直肠癌细胞系中miR-181d通过保护c-MYC蛋白免受FBXL3和CRY2介导的降解而促进有氧糖酵解，证实了CRY基因参与的c-MYC蛋白降解是重要的肿瘤保护机制。Mazzoccoli等[14]对50例结直肠癌组织及癌旁组织中CRY基因表达进行测定，荧光定量聚合酶链反应(qPCR)结果显示，相比于癌旁正常组织，结直肠癌组织中CRY1和CRY2mRNA水平均显著降低，提示CRYs低表达与结直肠癌发生相关。在临床和病理特征上，肿瘤组织中较低的CRY1表达水平与年龄(62～74 岁)、女性以及肿瘤位置(横结肠)存在显著的相关性，同样CRY2低表达与肿瘤位置(横结肠)相关，根据其研究结果，推测结直肠癌在60～74岁人群及女性中好发，好发部位为横结肠。与流行病学研究一致的是老年人中结直肠癌的发病率较高，但好发部位位于远端结肠和直肠，且男性发病率高于女性[15]。因此，并不能单纯使用CRY基因表达水平来预估结直肠癌发病风险，还需要更深入研究CRY基因在结直肠癌中的具体作用及机制。

3.2CRY基因与肝癌 肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma， HCC)和胆管细胞癌(cholangiocarcinoma, CCA)占原发性肝癌的绝大多数，是我国第2大癌症相关死亡原因[16]。生物钟紊乱可引起小鼠肝脏代谢整体性改变，不仅通过加速细胞质糖酵解促进脂肪的合成和储存，而且增加氧化应激和支持细胞快速分裂的前体合成，从而促进肝纤维化和原发性肝癌进展[3]。近期研究发现CRY1在肝癌组织及癌旁组织中表达水平显著低于正常肝组织，且其表达水平与肿瘤浸润、淋巴结转移相关[17]。Mteyrek等[18]实验证实了CRY基因异常与肝癌相关，经二乙基亚硝胺(DEN)诱导5个月后，与野生型小鼠相比，CRY1-/-CRY2-/-小鼠出现了严重的肝发育不良，天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶和碱性磷酸酶水平数倍升高；组织病理学检查发现DEN暴露诱导的原发性肝癌数量(包括HCC及胆管癌)是野生型小鼠的近5倍，但HCC平均数量没有显著差异，CCA平均数量增加了近8倍，CRY1及CRY2基因低表达可能是原发性肝癌(尤其是CCA)的重要危险因素。另有研究纳入489例接受根治性切除术的HCC，对13种节律基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms， SNPs)与临床预后分析发现，携带CRY1rs3809236变异基因的患者相比野生纯合子型，肝癌的总生存率降低且复发率增加[19]。CRY1rs3809236位于CRY1基因转录因子结合区，可能导致CRY1基因mRNA表达异常，结合上述研究表明，CRY1蛋白表达水平与肝癌发生、发展、预后相关，而是否存在CRY1rs380923可作为评估预后的标志物。

3.3CRY基因与胃癌 丁海滨和杨勇[20]对106份胃癌组织及癌旁组织标本研究发现，CRY1蛋白阳性表达率显著高于癌旁正常组织，且与浸润深度、组织学分化程度以及TNM分期相关，且经随访发现CRY1阳性和阴性患者5年总生存率分别为58.33%(28/48)和79.31%(46/58)，表明CRY1阳性表达降低了胃癌预后。然而，癌症基因组图谱数据库分析却显示CRY2基因在胃癌组织中低表达，涉及CRY2基因在胃癌中功能研究却罕有报道[8]。有研究表示DNA损伤后，CRY1和CRY2具有不同的功能，CRY1-/-细胞对基因毒性应激的转录反应增强，而CRY2-/-细胞则减弱[21]，也许可以解释CRY1、CRY2在胃癌组织中表达差异形成原因。

3.4CRY基因与胰腺癌 Relles等[22]采用实时荧光定量聚合酶链反应测定胰腺导管腺癌肿瘤组织(n=65)、邻近正常胰腺组织(n=34)及胰腺良性病变组织(n=16)中CRY1和CRY2mRNA表达水平，并按中位数分为高低表达组分析其预后相关性，发现CRY2低表达组中位存活时间明显缩短，且2年生存率约为高表达组的一半(22.3% vs 43.9%，P=0.0270)。由此可见，CRY2基因表达下调与胰腺癌生存预后相关，可作为预测胰腺癌生存结局的标志。而与正常胰腺组织及胰腺良性组织(包括胰腺腺瘤、囊腺瘤、上皮性囊肿或导管内乳头状黏液肿瘤)相比，肿瘤组织中CRY2基因表达降低，因此CRY2基因还可能作为胰腺肿瘤标志物区分良恶性病变，但需要更大样本的研究来证明其临床意义。

3.5CRY基因与乳腺癌 乳腺癌位居我国女性恶性肿瘤发病率首位，且呈缓慢上升趋势，明确其发病机制对其防治有重要意义[16,23]。倒班工作造成的昼夜节律紊乱已被国际癌症研究机构分级为可能的人类致癌物2A组，大量流行病学研究表明夜班工作会增加乳腺癌的发病率和病死率，基因特异性和全基因组分析显示，长期倒班工作导致多个节律基因启动子甲基化以及癌症相关基因的类似变化[4]。Mao等[24]发现与健康对照组相比，乳腺癌患者CRY2启动子甲基化程度更高。他们同时探索了CRY2与乳腺癌患者临床参数的相关性及其在DNA甲基化等表观遗传过程中的参与。通过对Oncomine数据库分析发现，与相邻的正常组织或健康对照组的乳腺组织相比，乳腺癌组织中CRY2表达下调；而且CRY2低表达与雌激素受体阴性、肿瘤高分化及较短总生存时间相关。全基因组甲基化分析显示共有1245个CpG位点随着CRY2基因敲除而改变，包括细胞增殖(BAG1、CHKA)、凋亡(BCL2、BCL3)、黏附(CD44、CADM1)、侵袭和迁移(GPR54、GCNT2和USP4)以及激素调节(NR3C1、MTNR1A和PRLP)等基因。因此，CRY2基因表达减少在乳腺癌中导致了广泛地与癌症相关的表观遗传失控，CRY2基因可能作为乳腺癌易感性、进展和预后的生物标志物。

3.6CRY基因与骨肉瘤 骨肉瘤作为青少年常见恶性肿瘤，化学治疗及手术治疗效果欠佳[25]。为探究节律基因异常对骨肉瘤发生、发展影响，Yu等[26]发现CRY2基因敲除促进了人骨肉瘤细胞的增殖和迁移，进一步研究发现CRY2敲除后基质金属蛋白酶2和β-catenin蛋白表达增加，基质金属蛋白酶2通过破坏细胞外基质成分促进肿瘤侵袭，而β-catenin的异常激活与多种肿瘤发展密切相关。基于上述研究，初步认为CRY2基因在骨肉瘤具有肿瘤抑制作用。同时发现CRY2敲除降低了p53的表达，增加了c-Myc和cyclinD1蛋白表达，并通过细胞周期分析发现S期细胞数量增加，G1期细胞数量减少，再次证实了CRY基因调控细胞周期参与了骨肉瘤的演变[26]。进一步研究发现CRY1施加其肿瘤抑制活性是通过活化Akt/p53/p21信号通路，发挥Cdk2的抑制作用，控制细胞G1/S期过渡[27]。上述研究表明了CRY基因与骨肉瘤发生、发展有密切联系，可能作为治疗骨肉瘤的目标靶点。

3.7CRY基因与其他肿瘤 除上述肿瘤外，关于CRY基因的研究还涉及其他肿瘤，包括子宫内膜癌、头颈部鳞癌、皮肤癌、神经胶质瘤、胸膜间皮瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病[28]、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌[29]及醛固酮腺瘤[30]等。CRY基因作为肿瘤抑制基因，在不同肿瘤中具体作用机制尚不清楚，但现有研究表明其在DNA损伤修复、细胞周期调控、组织代谢及慢性炎症等方面均起到重要作用，有待进一步的研究来佐证[3,5,31-32]。

4 CRY基因与肿瘤化学治疗

4.1CRY基因与结直肠癌化学治疗 随机选择16例Ⅲ期原发性结直肠癌接受新辅助化学治疗前肿瘤组织标本，分为完全缓解和部分缓解组，肿瘤稳定和肿瘤进展组各8例，发现肿瘤稳定和肿瘤进展组具有更高的CRY2表达，表明CRY2高表达可能对新辅助化学治疗存在不利影响[33]。Fang等[33]对289例结直肠癌Kaplan Meier生存曲线分析发现CRY2高表达与较低的生存率相关，在接受辅助化学治疗的患者中其相关性更明显。为了进一步研究CRY对结直肠癌化学治疗的影响，使用特异性siRNA下调CRY2在DLD-1、SW480 细胞系中表达，结果加速了奥沙利铂诱导的细胞凋亡，表明CRY2低表达增加了结直肠癌细胞对化学治疗的敏感性。研究发现FBXW7(F-box and WD repeat domain-containing 7)过表达提高了结直肠癌细胞株对奥沙利铂的敏感性，而CRY2以剂量依赖性方式随着FBXW7增加而降低,FBXW7通过提高CRY2泛素化水平负向调控CRY2的稳定性，因此FBXW7-CRY2轴在化学治疗敏感性中至关重要，同时在289例人结直肠癌肿瘤组织中观察到FBXW7-CRY2轴的失调[33]。以上证实CRY2表达水平可能用于预测结直肠癌患者对化学治疗的敏感性，而对CRY2蛋白抑制将是一种有效的治疗方法用于克服肿瘤耐药性的形成

4.2CRY基因与胃癌化学治疗 Qu等[34]使用COX回归模型，对1030例胃腺癌根治性切除术总生存率和5种节律基因(CRY1-2、PER1-3)中13个SNPs进行相关性分析，其中包括CRY1rs1056560在内的3个SNPs被证明与胃癌总生存率高度相关，并且在CRY1rs1056560等位基因突变型(TG/GG)胃癌患者中，铂类辅助化学治疗对患者生存预后具有更显著保护作用，表明CRY1rs1056560可能作为胃癌对铂类药物敏感性的预测性标志物。SNPs在调控基因表达、mRNA降解和翻译及影响蛋白质生物学功能的蛋白质结构中发挥着重要作用，相比于野生纯合子基因型(TT)患者，基因突变型(TG/GG)CRY1基因mRNA 表达水平明显下调，表明rs1056560这一可遗传的变异降低了CRY1合成，结合上述研究，证实胃癌化学治疗预后与CRY1基因低表达呈正相关。

5 小结

由于消化和内分泌功能具有明显节律性与我们进食、作息相关，如上述，昼夜节律紊乱更多地增加了相关癌症易感性[29,35]。可以看到，节律基因CRY作为肿瘤抑制基因，参与了细胞周期、DNA损伤及组织代谢过程，其异常表达与癌症的发生和发展相关，同时也影响了化学治疗的敏感性和预后。未来临床对于CRY基因的检测，可能作为预测相关肿瘤风险以及化学治疗敏感性的重要指标；如能进一步人为调控CRY基因在肿瘤组织中表达，抑制肿瘤发展，将为肿瘤的治疗提供新方向。