颅脑创伤后的病理生理改变及相关生化标记物研究进展

姚庆海，刘保龙

颅脑创伤（TBI）引起的病理生理进程取决于 原发性机械损伤（局灶性或弥散性）与继发性脑损伤之间的复杂相互关系。继发性脑损伤是多重细胞因子级联反应（包括炎性因子、氧化应激和兴奋性毒性反应）引起的神经元代谢异常和血流动力学紊乱，继而导致脑组织缺血、颅内压增高、脑组织水肿（血管性和细胞毒性）、弥漫性轴突损伤和出血等。所有这些病理反应会进一步加重炎症反应、氧化应激和细胞毒性反应，并最终导致神经元坏死和凋亡［1］。继发性脑损伤引起的神经元损伤与创伤性轴突损伤（肿胀，断开和沃勒氏变性）一样会持续数周、数月甚至数年［2］。从临床角度来看，TBI 患者慢性期的特征主要表现为认知和行为改变，运动和感觉系统（包括触觉，视力，嗅觉，前庭）的功能障碍，植物神经功能紊乱以及疼痛和睡眠障碍等并发症。一些轻度颅脑损伤患者也会出现执行能力障碍、注意力和记忆力下降，大脑处理速度慢，认知灵活性降低，和心理情绪障碍等［3］。本文将着重介绍与TBI 后与诊断、预后评估相关的生化标记物及不同标记物评估脑损伤的作用，以及生化标记物在TBI 诊断、治疗、预后中的最新研究进展。

1 生化标记物在TBI 筛选和评估中的应用

临床工作中经常通过生化标记物对疾病进行诊断、预后评估和检测治疗效果。TBI中生化标记物可以检测损伤导致的细胞、生化和多种因子水平的改变来发现影像学检查无法显示的早期微病变。

格拉斯哥昏迷量表（GCS）是TBI 的标准评估分级，该量表将颅脑损伤的程度和预后分为轻度（GCS 13-15），中度（GCS9-12）和重度。

尽管有大量相关文献，但仅斯堪的纳维亚神经创伤指南提出建议对于怀疑或证实失去意识和/或反复呕吐的低风险轻度TBI 患者（GCS14 或GCS15）的6 小时内使用生物标志物（S100B）作为筛查工具的建议［4］。

有meta 分析发现急诊通过S100B 的筛查有助于识别颅内损伤［8］。此外，泛美素C 末端水解酶L1（UCH-L1）和神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）在评估轻度TBI 中的可信度已通过美国食品和药物管理局［5，6］的验证，其灵敏度和特异度比 S100B更高［7，8］。同时还有其他几种生化标记物或生化标志物的联合应用在检测脑内病变方面时比S100B 具有更高的敏感性，目前仍需要进一步的研究得出明确的结论。

2 弥漫性/创伤性轴突损伤的检测

由于CT 上较难检测弥漫性轴突损伤，因此可以使用生化标志物来区分局灶性弥漫性损伤与弥漫性损伤或评估与DAI 严重程度。

大多数研究集中于轴突蛋白，例如神经丝，血影蛋白降解产物和tau 蛋白或淀粉样β肽，这些蛋白均在轴突损伤后出现，通过对重度TBI 患者进行微透析可以评估［9，10］。胶质神经元比率（以泛素羧基末端水解酶-L1（UCH-L1）之间的相关性衡量）和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）被认为是重度TBI 的标志，且 DAI 中比局灶性病变水平更高［11］。

一项研究表明金属硫蛋白作为一种神经保护蛋白在脑损伤后3-6 天血清水平较高，可以用于DAI 的鉴别［12］。最新研究发现脑脊液中微管相关蛋白 2（MAP 2）水平与 DAI 损伤程度相关［13］。血清生化标记物的水平可以用于局部病变和弥散性病变的诊断［14］。

监测生化标记物对头CT 正常的DAI 患者具有很好的临床价值，同样也可用于评估血脑屏障（BBB）完整性。无论脑损伤的严重程度如何，均可发生血脑屏障破坏［15］。即使有大量关于BBB 通透性的基础研究，但由于不能无创地评估BBB 的完整性，其在临床实践中的应用受到限制。白蛋白（QA）是同一时刻CSF 和血清中白蛋白的商，是评价BBB 功能的金标准。QA 与12 小时内血清S100B［16］和泛素 C 末端水解酶 1（UCH-L1）［17］水平相关。Vajtr 等研究发现血清S100B 水平与血脑屏障超微结构（内皮细胞和星形胶质细胞）的变化有关。同样，S100B 水平增高与高IL-6 相关，表明炎症反应影响血脑屏障通透性。在非手术患者中MMP-9 和MMP-2 水平增高，提示炎症反应和BBB功能的改变［18］。最近也有研究指出重度TBI患者脑脊液中的磺酰脲受体1与CT水肿和颅内压有关，较低的磺酰脲受体1 水平提示患者症状较轻［19］。

无论原发性损伤或继发性损伤均可能引起TBI 后颅内出血，因为它也与BBB 功能障碍有关。微透析结果提示创伤性蛛网膜下腔出血时IL-1β，IL-6 和 IL-10 的水平升高，而 FGF2 和 VEGF的浓度更高。进行性颅内出血时ICP 升高，脑脊液和尿液S100-B 也随之升高［20］，且血清 D-二聚体（TBI 凝血功能）水平高［21］。在TBI 追踪研究中发现NF-L 在区分患者CT 是否颅内出血敏感性很高，同样可以用于DAI 患者［10］。

3 TBI 生化标志物作为预测死亡率和致残率等相关研究

大量文献发现与TBI 的预后生物标志物有关，与短期预后有关，尤其是死亡率。由于最新测试的大量生物标志物，我们将其按功能进行分类。

3.1 神经元损伤和胶质细胞损伤相关生化标记物

与神经元损伤和胶质细胞损伤相关生化标记物研究最多的是 S100B、GFAP、NSE 和 UCH-L1等。此外还有少量与细胞凋亡和蛋白水解等相关生化标记物的研究。在TBI 中，细胞坏死和凋亡均由继发性损伤引起的生化级联反应触发。

凋亡是由促凋亡因子和抗凋亡因子（即caspase 与Bcl-2 家族蛋白）失衡导致的。程序性细胞死亡的终点是DNA 断裂和细胞核结构破裂［22］。重度TBI 后Caspase-3 和其他促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的增加与患者预后不良相关［23］。Darwish 等在重度TBI 患者的脑脊液中检测到了激活的caspase-9 和细胞色素c，这些生物标志物也与预后不良有关［23］。

AlphaⅡ-血影蛋白是皮层有髓神经元轴突Ranvier 结的重要组成部分，calpain 和 caspase 家族蛋白水解酶被激活后被水解为AlphaⅡ-血影蛋白分解产物（SBDP）。临床研究对calpain 和caspase激活生化标志物进行定量分析结果相似。Calpain酶激活生化标志物SBDP 145 和SBDP 150 的峰值比caspase 酶激活生化标志物SBDP120 早，并且两种蛋白酶导致的SBDP 水平增高均提示预后不良和死亡风险较高［24］。同时，SBDP150 和 SBDP145的水平比SBDP120 更高提示Calpain 酶的激活高于caspase 酶。此外，caspase 酶激活生物标志物与损伤的严重程度和不良的预后相关［25］。

3.2 与弥散性血管内凝血相关的生化标志物

一些TBI 研究中发现约50%的患者存在凝血功能异常，且与不良预后相关。凝血酶原时间（PT），部分凝血活酶时间（PTT），纤维蛋白降解产物（FDP）和D-二聚体测试（D-DT）等纤维蛋白溶解标记物的增高与GCS 评分低存在相关。此外，PT和FDP 与死亡风险增加相关［26］。在另一项前瞻性研究中发现脑脊液和血浆中促凝微粒（MP）持续增高提示预后不良［27］。横田等发现血栓调节蛋白（TM）和血管性血友病因子（vWF）的血清水平与损伤类型和患者年龄相关，颅内血肿患者中内皮细胞激活最明显，其次是局灶性脑损伤患者，而DAI 患者水平最低。此外，与年轻患者相比，老年患者的内皮细胞活化程度更高［28］。

3.3 与颅内压增高和脑关注不足相关的生化标志物

高颅内压（ICP）和脑灌注不足（CH）是由继发性损伤中的炎症反应引起的，与发病率和死亡率密切相关。在ICP 和CH 升高的患者中，血清中的IL-6［29］，IL-8和肿瘤坏死因子（TNF）-α水平升高［30］。ICH 患者的血浆铜蓝蛋白水平低于无ICH 的患者，铜离子载体浓度降低导致血清铜离子水平下降。在TBI 急性期自由基增多使铜离子氧化，从而导致铜蓝蛋白释放铜离子，并降低铜蓝蛋白半衰期。游离铜和铜蓝蛋白水平降低会进一步增加氧化应激，导致 BBB 损伤和水肿［31］。在对 DAI（或创伤性轴索损伤（TAI））患者进行的微透析时发现间细胞因子，ICP 变化，脑组织氧合作用和水肿之间无明显相关性（同CT 表现一致）［32］。

另一个与ICP 升高相关的生化标志物是肌酸（一种L-精氨酸的代谢产物）。重度TBI 患者中合并 ICH 的血清肌酸水平低于无 ICH 患者［33］。TBI，脑卒中和蛛网膜下腔出血等急性脑损伤的脑水肿和ICH 患者脑脊液中缓激肽的浓度均增高［34］。脑脊液中大量由星形胶质细胞产生的S100B 与ICP和 CH 均相关，而 NSE 水平仅与 CH 相关［35］。此外，ICH 与脑脊液中C-Tau 蛋白升高与ICH 有相关性［36］。血清 S100B 水平增高与 TBI 患者 IL-6 水平和出血有关［37］。微透析研究表明乳酸/丙酮酸比值升高的患者发生 ICP 的风险增加［38］，而 CH 患者的细胞外甘油水平升高［39］。

3.4 与神经炎性反应和氧化应激相关的生化标志物

神经炎性反应在TBI 的第二阶段起着至关重要的作用。临床研究中多采用微透析技术分析TBI 患者脑脊液中白介素因子和趋化因子的水平。IL-18 在重度损伤和认知障碍的患者中升高，也与神经炎性反应和神经变性有关［40］。此外，多项研究对ICU 患者进行微透析发现白细胞介素水平与损伤程度存在相关性［41，42］。MMP 对细胞因子和细胞因子受体具有调节作用。微透析液中MMP-8 和 MMP-9 升高与 IL-1α，IL-2 和 TNF-α的升高有关，而MMP-7 降低与IL-1β，IL-2，IL-6 升高有关。最近有研究认为IL-33 是重度TIBI 患者潜在的神经炎性生物标志物，与严重程度和预后不良有关［43］。除了与细胞因子之间相互作用外，MMP-7 和 MMP-8 还与 ICP 变化相关，ICP 患者 MMP-7 降低而 MMP-8 升高。此外，MMP-8 和 MMP-9 升高还与死亡率增加相关［44］。血清脂联素也与炎症调节有关，其水平增高提示死亡率增加和预后不良［45］。

硝基酪氨酸是由酪氨酸经活性氮介导硝化作用后产生的，脑损伤72 h 内可以在脑脊液中检测到硝基酪氨酸，其水平增高与不良预后相关［46］。氧化应激的另一个指标是F（2）-异前列腺素8-异前列腺素F（2α）（8-异-PGF［2α］），它是由花生四烯酸的非酶自由基催化的过氧化作用产生的。TBI 后第1～8 天每天检测两次血清和CSF 中8-iso-PGF（2α）水平发现CSF 水平显著高于血清水平且与其他氧化应激标记物（包括CSF 谷氨酸和甘油）水平相关［47］。在一项对106名重度TBI患者的研究中也发现血浆8-iso-PGF（2α）水平与临床预后相关，其对患者 1 年内的预后准确性与 GCS 相似［48］。

4 新型生化标记物的检测，多种生化标记物的联合及生化标记物与其他预后评估方法的比较

有学者通过将生化标记物与其他预后评估方法相结合进行研究，与血清生化标记物（S100B，NSE，IL-6，IL-8，IL-10，L-选择素，SICAM 和内皮素）或GCS 相比，两者联合使用能更好的评估患者预后［49］。对于轻度 TBI 患者联合 S100B 及 NSE 和临床危险因素（如恶心，健忘，呕吐和意识丧失）也能更好地评估患者预后［50］。

一种联合生化标记物的评估TBI 的方法是通过检测血清GFAP 与UCH-L1 的比率推断胶质细胞/神经元的比率。重度TBI 局灶性病变患者的GNR 高于 DAI 患者，且 GNR 与 GCS 和死亡率存在相关性。此外还可以通过磷酸化的tau 蛋白比率对TBI 患者进行评估。

TRACK-TBI 研究表明，在196 例所有记性重度 TBI 患者血浆 P-tau 蛋白，T-tau 蛋白以及 P-tau/T-tau高于健康对照组。与Tau蛋白相比，急性期血浆P-tau 蛋白和P-tau/T-tau 之比可以更好地评估与后（6个月时的GOSE）［51］。将UCH-L1和GFAP 联合使用对于诊断和评估与后具有更好的敏感性和特异性［52］。当 UCH-L1，GFAP 和αII 血影蛋白分解产物升高时，将其联合使用有助于对神经认知功能障碍进行评估［53］。有研究证实 CK-BB 与 S100-B 联合使用比单独使用S100B 更好地反应患者预后［54］。

此外，将 IMPACT 扩展评分与 UCH-L1，aII-血影蛋白分解产物（SBDP150，SBDP145，SBDP120），MAP-2，S100b 和MBP 等生化标记物联合使用可以更好地预测6 个月后的死亡率［55］。有研究通过检测 49 例重度 TBI 患者血清 MMP-9 和 c-Fn 为评估患者住院时间和死亡率提供了评估价值［56］。

将生化标记物与基因组学结合也可以对患者进行评估。有研究在对重度TBI 患者进行颞叶切除的解剖病理学研究中分析了患阿尔茨海默氏病的潜在风险［57］，重度TBI 和皮质斑块的患者具有较高的可溶性Abeta（1-42）水平，但没有Abeta（1-40），其中一半是apoE epsilon4（ε4）等位基因携带者。此外apoEε4 等位基因会增加外伤造成损伤的敏感性，apoEε4 阳性患者更容易发生脑组织细胞损伤，外伤后血清S-100B 和NSE 血清水平升高更明显［58］。

蛋白质组学，代谢组学和microRNA 是当前研究TBI 诊断和预后评估的热门方法。MicroRNA 是低分子量非编码RNA，在转录后基因调控中起重要作用。基因与microRNA 之间的关系具有多重性（一个microRNA 可以调节数百个基因，有时甚至具有逆功能）和协作性（一个基因由一个以上的microRNA 调节），从而形成了多个水平调节的动态网络［59］。对TBI患者外周血或CSF中不同microRNA（表达增加或减少）的检测均提示对疾病的诊断和预后有很好的特异性和敏感性［60］。

蛋白质组学通常使用质谱法通过自上而下或自下而上的方法进行研究。自下而上的蛋白质组学分析是指通过从复杂蛋白混合物中分离酶蛋白进行分析，通常会产生大量具有生物标志物价值和干扰的分子。自上而下的分析是指无需进行酶分离即可进行完整蛋白的分析。这种方法有可能忽略重要的新蛋白质分子［61］。在TBI 的诊断和预后评估中蛋白质是一个新兴领域。尽管有研究认为与对照相比TBI 的蛋白质组学变化，但是蛋白质组学分析作为一种预后工具的作用的研究还不够［62，63］。

类似于蛋白质组学，代谢组学定义为对大量低分子代谢化合物（代谢物）的分析，包括核磁共振波谱法和质谱法检测目的代谢物；而非通过气相色谱法或液相色谱法标记［64］。通过尿液，血液或CRF 的代谢组学分析进行了几种类型的研究，在诊断和预后价值方面均取得了令人满意的结果［65］。

5 生化标记物对TBI 后认知功能的预后价值

大多数关于TBI 中生化标记物的临床研究目的都在于研究其对诊断（尤其是在轻度TBI 中）和预后（死亡率或低GOS/Glasgow）的评估。但是，创伤性伤害的长期后果还多方面的认知障碍和情绪障碍。有综述和meta 分析探讨了S100B，NSE 和脑震荡后症状（包括认知功能）之间的相关性［66，67］，两项评价均得出这些生化标记物不是轻度TBI 后长期预后的有效独立预测因素。在重度TBI 患者中，我们发现只有两项关于急性或亚急性期的生化标记物水平与认知功能的研究。一项研究通过检测血液IL18（检测时间点不详）发现其与损伤后长达216 天内的认知功能无明显相关性［41］。另一项研究在创伤后遗忘症患者2 周内检测S100B 并进行神经心理学测试，发现反应时间，信息处理效率，口头和视觉记忆，概念性问题解决和口头流利度之间存在显著相关性，其中相关性最明显的是在S100B 和反应时间，没有发现生化标记物与抑郁焦虑压力量表之间的相关性［68］。在对无脑震荡的美式足球运动员的研究发现S100B 与认知测试结果之间存在显著相关性［69］，而在反复发生脑震荡事件的受试者中S100B 水平较高。在TBI 慢性期对血清代谢组学的测试发现有无认知障碍的患者之间血清代谢组学存在显著差异［70］。

6 TBI 生化标记物作为监测工具的潜力

已有多项研究将生化标记物用于监测针对维持脑灌注压（CPP）和降低ICP 的治疗。肌酐清除率，乳酸与丙酮酸（L/P）之比［71］，氧化应激生物标志物［72］，S100B 和 NSE［73］等多用于评估治疗效果。最近一项研究中，通过S100B 评估接受高渗盐水和甘露醇的患者，发现接受甘露醇治疗的患者血清 S100B 水平较低，GCS 评分更高［74］。Shore等比较了在严重TBI 后接受连续或间歇性CSF 引流的患者的神经元损伤（NSE），神经胶质损伤（S100B），炎症（IL-6）和再生（VEGF）的CSF 生物标志物水平。间歇性引流与脑脊液中NSE，S100B，IL-6 和 VEGF 的浓度升高有关［75］。Taguy 等通过微透析检测重型TBI 手术治疗中分别使用丙泊酚和咪达唑仑的患者发现，两组患者之间的L/P 比例，谷氨酸或葡萄糖水平没有差异［76］。最近一项有关重度TBI 患者左旋肉碱影响的研究发现尽管治疗7 天后神经行为功能和脑水肿程度有所改善，但未能降低 NSE 水平［77］。对中重度 TBI 患者促红细胞生成素治疗对UCH-L1 和NF-L 水平的影响结果也未见明显差异［78］。

7 结 论

生化标记物可以提供有关TBI 病理生理过程的可靠信息，并用于患者的评估。然而是否存单个理想生物标志物实现这一目的仍然未知。目前研究结果是研究随临床症状、影像学结果变化的多种生化标记物的变化趋势，对不同状态、不同影像学表现的TBI 患者进行动态的个体化评估。此外，生化标记物的连续检测可以提供患者受伤后更准确的分子生物学改变。尽管有关生化标记物的研究很多，但仍有一些主题需要进一步研究：①目前已明确在TBI 中单一检测不能反映患者的整体状态。因此，需要在不同的时间进行一系列复杂的神经心理学评估［79］。为了获得更好的结果，应该在急性/亚急性阶段评估生化标记物，并与多种预后评估手段联合应用。②蛋白质组学，代谢组学和microRNA 是新兴领域。其共同的挑战是所有这些化合物都在高度复杂的网络中发挥作用，因此需要研究这些实验室领域的生物信息学和系统生物学之间的相互作用［80，81］。在研究复杂的相互关联的分子过程中，最新的生物信息学和系统生物学是必不可少的，它提供了有关分子相互作用和途径的综合观点。由于这些实验室分析的复杂性和高昂成本，目前大多数临床研究中此类生化标记物的价值有限。但是，即使不可能大规模应用，这类研究也可用于研究低成本生化标记物的进一步应用。③神经营养蛋白，生化标记物和基因组学的结合以及将生化标记物用作治疗监测工具需要进一步研究，以及如何明确生化标记物检测可以使患者从中受益。