七氟烷对野百合碱诱导的右心室肥厚的影响

尹小清，邹军，王锷

肺动脉高压继发右心室肥厚患者围术期严重不良事件发生率及死亡率很高，而受损的右心功能障碍加重是其主要原因之一［1，2］。七氟烷是临床上最常见的吸入麻醉药之一，大量研究证实了其在心脑血管手术麻醉中的优越性，但是目前针对七氟烷与肺动脉高压和右心功能的研究很少。有研究显示较高浓度七氟烷会产生系统性低血压并严重损失右心功能［3］；另有研究者发现0.5%七氟烷可降低肺动脉压力而不影响循环血压，可用于急性肺动脉高压的治疗［4］。因此作者推测较低浓度七氟烷可能对肺动脉高压及右心功能不全有利，本实验拟研究0.5%、1.0%、1.5%三个浓度七氟烷对肺动脉高压及右心室肥厚大鼠的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和主要仪器

野百合碱（monocrotaline，MCT，美国 Sigma 公司，批号C2401），七氟烷（日本丸石制药株式会所，批号29071），心室压力容积导管（PV 导管，1.9F，美国 Millar 公司），iNOS 蛋白试剂盒（英国Abcam 公司，批号ab3523），sGCβ1 蛋白试剂盒（美国Cayman 公司，批号160897）。

1.2 动物分组与模型构建

健康雄性SPF级SD（Spague-Dawlay）大鼠30只，体重250～300 g，由中南大学动物实验中心提供，采用随机数字表法将其分为空白对照组（C 组，n=15）和野百合碱组（M 组，n=15），M 组腹腔单次注射1%野百合碱60 mg·kg-1，C 组腹腔单次注射相同容积溶剂。所有大鼠均正常饲养于动物实验中心。

1.3 实验方法及血流动力学检测

大鼠建模后饲养4 周，称重后腹腔注射氯胺酮注射液60 mg·kg-1麻醉，仰卧位固定，于颈正中切口行气管穿刺置管（16G 动静脉留置针），连接至小动物呼吸机行机械通气（潮气量5 mL·kg-1，频率 70～80 次·min-1）。于股动脉穿刺置管监测血压、隐静脉穿刺置管用于术中输液。单次给予舒芬太尼1 μg·kg-1及维库溴铵1 mg·kg-1后以舒芬太尼1 μg·kg-1·h-1和维库溴铵3 mg·kg-1·h-1的持续泵注。行正中开胸，予3 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa）呼气末正压防止肺塌陷。直视下于心尖处刺破右室沿右室长轴置入1.9F 压力容积导管。手术过程中持续泵注复方电解质注射液（10 mL·kg-1·h-1）维持血容量，调节并维持体温在37℃～38℃。

手术操作完成血流动力学稳定后，采集基础值数据，两组大鼠分别梯度吸入0.5%、1.0%、1.5%浓度七氟烷，每个浓度均吸入30 min。每个浓度下呼末麻醉气浓度稳定于预设值15 分钟后开始记录数据，每5 分钟为一个时点，选取大鼠机控呼吸暂停、血流动力学稳定后10～20 个连续周期进行数据采集。所有数据通过PowerLad 数据采集系统持续采集，并通过LabChart 软件进行分析和存储，得到以下数据：心率（HR）、右室收缩末压力（RVSP）、右心室压力最大上升速率（dP/dt max）、右室每搏量（SV）、右室心输出量（CO）、右室射血分数（EF）、肺动脉有效弹性（Ea）等。

1.4 右心室肥厚指标测量及组织形态学观察

血流动力学检测后立即处死大鼠，快速分离心脏，放入-20℃冰箱内速冻15 分钟后取出，于心脏中段沿心室横轴切2 mm 厚切片，选取最佳切面（心室乳头肌平面）进行拍照，并用Image-Pro Plus软件分析右、左心室室壁厚度，计算得出右/左室室壁厚度比值（R/L 室壁厚度）。拍照后将心脏右室游离壁（RV）、左心室和室间隔（LV+S）完整分离并分别称重，计算心脏重量（HW）、右心室质量指数（RVMI）=RVW/BW、右室肥厚指数（RVHI）=RV/（LV+S）。剪取部分右室心肌组织放入4%多聚甲醛内固定，依次常规石蜡包埋、连续切片及苏木素-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察心肌组织病理改变并采集图片。

1.5 Western blot 检测右室心肌中 iNOS 及 sGC 的表达

取右室心肌组织匀浆，离心后取上清液，采用BCA 法进行蛋白定量。每例取50 μg 蛋白变性，进行SDS-PAGE 电泳，电转至PVDF 膜上；脱脂奶粉封闭后，依次加入一抗（1∶200 兔抗sGCβ1 抗体，1∶200 兔抗 iNOS 抗体，1∶4000 鼠抗β-actin 抗体）及HRP 标记的二抗（1∶4000 羊抗兔或羊抗鼠）；ECL显影，扫描胶片，用graph pad 图像分析软件进行灰度扫描分析，同时以β-actin 作为内参照，计算目的蛋白表达的百分率。

1.6 统计学分析

实验数据均采用均数±标准差（）表示，应用SPSS 19 软件进行统计分析。两组大鼠形态学数据及相同时点血流动力学数据的比较采用两样本t检验。两组大鼠术中不同时点血液动力学数据组间比较采用重复测量单因素方差分析，血流动力学变化幅度的比较采用Z检验（n＞40）；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 右心室肥厚结果

两组大鼠右室肥厚测量结果如表1 所示，与C 组大鼠比较，M 组大鼠平均体重（BW）降低，RVMI、RVHI 及R/L 室壁厚度均明显增加。心脏组织肉眼观可见M 组大鼠右心室游离壁较C 组明显增厚，右心室内乳头肌和肉柱亦显著增粗（图1）。

表1 两组大鼠右室肥厚测量结果（n=15，±s）

2.2 右室心肌组织病理改变

HE染色结果显示：C组大鼠右室心肌纤维排列整齐，胞浆染色均匀，胞核大小均一（图2A、2C）；M 组大鼠右室心肌纤维排列紊乱，间隙增宽，细胞肥大增粗，胞核大小不一，心肌间质纤维增生，伴有炎性细胞浸润（图2B、2D）。

2.3 血流动力学数据结果

两组大鼠吸入不同浓度七氟烷时主要血流动力学数据结果显示在表2 中。从基础值可以看出，M 组大鼠 RVSP、Ea、dP/dtmax 均明显高于 C 组，而两组大鼠间MAP、HR、CO、SV、EF 均无明显差异。

随着七氟烷吸入浓度递增，两组大鼠MAP、RVSP、CO、EF、dP/dtmax 逐渐下降，EDV 逐渐增大。C 组大鼠 Ea 无明显变化，M 组大鼠 Ea 逐渐减小。两组大鼠吸入不同浓度七氟烷后许多血流动力学指标变化趋势相似，但是变化幅度不同。两组大鼠吸入七氟烷后CO 均下降，但是C 组随吸入浓度增加而逐渐下降而M 组无此下降趋势；两组EF 和dP/dtmax 均随七氟烷浓度递增而逐渐降低，且M 组下降幅度更小；C 组SV 在0.5%时无明显变化，在1.0%及1.5%时下降且有浓度梯度效应，M组SV 在吸入七氟烷后下降但无浓度梯度效应。总的来说，七氟烷吸入导致的M 组大鼠dP/dtmax、CO、EF 及 SV 下降幅度均较 C 组小。

表2 两组大鼠主要血流动力学数据（n=15，±s）

2.4 右室心肌iNOS 和sGC 含量检测结果

Western blot 结果（图3）显示：梯度吸入七氟烷后，M 组大鼠右室心肌组织中iNOS 表达高于C组，而sGCβ1 表达低于C 组。

3 讨 论

本实验采用腹腔单次注射野百合碱建立大鼠右心室肥厚模型，观察探讨了七氟烷吸入对其右心功能的影响及可能机制。野百合碱可损伤大鼠的肺血管内皮细胞，进而引起肺小动脉收缩、重塑，导致肺动脉高压继发右心室肥厚，此方法简便有效，因此常被用来建立肺动脉高压和右室肥厚及右心衰动物模型［5，6］。本实验结果显示，M 组大鼠右心室室壁增厚，右室肥厚指数升高，RVSP、Ea升高；HE 染色结果亦显示了心肌肥厚的病理改变，证明大鼠右室肥厚模型建立成功。M 组大鼠RVSP 和Dp/dtmax 高于 C 组，但两组大鼠 MAP、HR、SV、CO、EF 均无明显差异，说明 M 组大鼠右室收缩力增强而心脏泵血功能尚处于正常状态，右心功能处于代偿期。本实验结果与其他实验结果较一致［3，7］。

七氟烷是临床常见吸入麻醉药之一，其可以直接扩张体循环血管或减低心肌收缩力引起体循环血压及阻力下降［8］，本实验结果亦显示MAP 在实验浓度范围内出现七氟烷浓度梯度依赖性降低。肺动脉有效弹性（Ea）可有效反映右室后负荷，本实验中吸入七氟烷后M 组大鼠Ea 减小而C 组大鼠Ea 无明显变化，提示七氟烷可降低右室肥厚大鼠的右室后负荷但对正常大鼠无明显影响。以往的一些实验也证实了在生理及病理情况下七氟烷不会影响肺动脉压-血流关系，不影响右室后负荷［3，9，10］。考虑到不同实验中选用的实验动物、样本量及吸入麻醉药浓度不同，本实验得出的较低浓度七氟烷可以降低右室肥厚大鼠的右室后负荷这一结果对后续研究有一定参考价值，需进一步进行深入研究。既往有实验发现吸入麻醉药会损伤右室收缩功能，且与剂量相关［9，11］。本实验亦发现七氟烷会损伤两组大鼠的右室收缩功能，并呈浓度依赖性，但右室肥厚大鼠损伤程度相对正常大鼠较轻。吸入1.5%七氟烷时，C组大鼠右室SV、CO 和EF 分别下降了22%、39%和43%，而M 组大鼠右室SV、CO 和EF 分别下降了13%、18%和9%，说明本实验中右室肥厚大鼠具有良好的心功能代偿机制。

生理情况下心肌中iNOS 表达很低，在心肌受到氧化应激等刺激下其表达可显著增加，进而催化生成大量 NO，NO 可与 sGC 结合，催化 GTP 生产cGMP，激活PKG 等通路，下调肌丝对Ca2+的敏感性，进而产生负性肌力作用［12］；此外，iNOS 上调导致的大量的氧自由基生成可使sGC 降解增加，表达下降［13，14］。许多肺动脉高压及右室肥厚动物模型可观察到iNOS 表达上调及sGC 表达下调，本研究前期实验亦证实了该现象［15，16］。七氟烷暴露可以增加氧自由基或羟基生成从而使sGC 脱敏，表达下调［17，18］，但其对 iNOS 的作用尚无定论，且目前尚无七氟烷影响右室肥厚动物iNOS 表达的明确证据。本实验中模型组大鼠吸入七氟烷后心功能抑制作用比正常大鼠更小，可以用sGC 表达减少来合理解释，sGC 表达下调可增强心肌细胞对Ca2+的敏感性，心肌收缩力增强。sGC 表达下调可能是七氟烷吸入或iNOS 表达增加的直接作用，但七氟烷是否通过增加iNOS 表达进而影响sGC 的表达尚需进一步探讨。

综上所述，60 mg·kg-1野百合碱单次腹腔注射可成功诱导SD 大鼠右心室肥厚，低浓度七氟烷可抑制SD 大鼠的右心功能，但右室肥厚大鼠较正常大鼠表现出更好的耐受性，这可能与心肌中iNOS表达增加及sGC 表达减少有关。