新辅助化疗对晚期上皮性卵巢癌免疫微环境的影响研究进展

董绍华 田翔宇 崔秀娟 王稳

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是最致命的妇科恶性肿瘤，由于缺乏有效的早期筛查手段，发现时多已处于广泛盆腹腔转移的晚期，确诊后5 年存活率仅为45%［1］。手术联合铂类为基础的化疗是EOC的主要治疗方法，是否完全切除肉眼可见病灶是影响预后的关键因素［2］。对于手术不能完全切除的FIGOⅢC期或Ⅳ期患者，新辅助化疗加中间型肿瘤细胞减灭术是可供选择的替代治疗方案［3］。尽管大多数卵巢癌患者对目前的治疗方案（紫杉醇/铂类化疗）有效，仍有70%的患者最终会出现复发和化疗耐药［4］。已有证据表明，宿主免疫系统在控制肿瘤生长方面起着重要作用，肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）与提高EOC患者的生存率密切相关，TILs的出现成为目前肿瘤免疫治疗的新策略［5］。本文将对TILs诊断和预后价值的最新进展做一综述，回顾新辅助化疗对晚期EOC免疫微环境的影响，以期为将来免疫治疗作为初始治疗后的维持治疗提供参考。

一、TILs治疗原发性卵巢癌对预后的影响

1.TILs与卵巢癌预后

TILs在卵巢癌中的作用已被证实，研究表明宿主免疫系统与肿瘤之间存在相互作用［6］。TILs 主要包括CD3+T淋巴细胞（含CD4+T细胞和CD8+T细胞两个亚群）、B 淋巴细胞以及自然杀伤细胞（NK细胞）等，这些细胞穿过血管系统定位于肿瘤组织或其周围的间质，并参与肿瘤生长的控制［7］。多项研究证实了TLLs 在卵巢癌中的重要预后价值。Li J等最近的荟萃分析中，纳入了21项不同的研究，涵盖近3 000 名患者，发现上皮内TILs 与卵巢癌患者的生存率有显著的相关性［8］。多项独立研究均证实了CD8+TILs 与卵巢癌患者的生存率显著相关［9-11］。此 外，也 有 研 究 报 道 了CD4+ TILs［9，12］以 及CD3+TILs［13］的预后意义，但相关程度相对较低。

卵巢癌中是否存在其他免疫细胞发挥作用，其研究结果相互矛盾。在一项对49例高级别卵巢癌大网膜标本以及59 例转移性卵巢癌患者的研究中，CD19+B 细胞浸润与较低的生存率相关［14-15］。与之相反，在一项纳入199 例卵巢癌患者的研究中，CD20+B细胞与生存率提高有关［16］。另一项研究表明，与存在CD8+TILs单独浸润的患者相比，CD8+CD20+TILs患者具有更好的预后［11］。

2.调节性T细胞与卵巢癌预后

细胞毒性T 细胞的招募和激活需要一系列紧密协调的相互作用，首先是与肿瘤抗原结合的HLA-I类分子，功能性抗原处理机制已被证明可以影响CD8+/CD3+TILs以及肿瘤浸润和生存，HLA-DMB以及HLA-HC的下调使TILs水平降低，从而导致晚期卵巢癌患者的生存率降低［17］。CD4+ CD25+Foxp3+ 调节性T 细胞（regulatory T-cells，Tregs），具有通过TGF-B和IL-10等细胞因子抑制免疫细胞活性的能力，并在巨噬细胞等其他细胞中诱导免疫抑制表型。浸润性卵巢癌组织中Tregs 水平更高，从而限制了抗肿瘤免疫活性并有利于肿瘤细胞的生长［18-19］。大多数研究证实肿瘤内Tregs聚集与其病理分期和分级有关，Tregs 水平升高预示着更低的生存率，但也有研究认为Tregs 可以改善患者的预后［20-21］。

3.TILs/Tregs与卵巢癌预后

事实上，卵巢癌细胞毒性和抑制性T 细胞之间的相互关系更能提供有价值的信息，例如，有研究证实了肿瘤内CD8+T 细胞/Tregs 以及CD8+CD4+T细胞/Tregs 比值增加，卵巢癌患者的总体生存率提高［22］。然而，现有的一些数据也与前述结果相矛盾，证实Tregs 可以改善预后［16］。尽管如此，目前流行的观点是卵巢癌微环境中Tregs 的存在抑制了免疫系统杀伤癌细胞的能力［7］。

二、EOC新辅助化疗的免疫调节作用

鉴于越来越多的晚期EOC 患者接受新辅助化疗，目前大多研究通过对TILs亚群进行定性和定量分析，评估新辅助化疗后免疫参数的变化。最近一项涉及150 名患者（包括83 名NACT 治疗前后配对患者）的研究，证实NACT 后间质TILs 水平显著升高，在多变量分析中，NACT 后间质中高TILs 水平仍然是无进展生存的预后因素。当考虑个体患者时，NACT 的免疫调节作用是可变的，一定程度反映了EOC 的异质性。超过一半的EOC 表现为间质TILs 和/或上皮内TILs 的募集，而1/4 的EOC 显示TILs 减少，这表明NACT 可能对肿瘤微环境有刺激或抑制作用。同样，NACT 对PD-L1 的表达有重要影响，NACT 前后PD-L1 的比例从30%显著提高到53%［23］。

在其他研究中，新辅助化疗后TILs的水平明显增加。Polcher M 等研究分析了30 例晚期EOC 患者NACT 前后上皮内TILs 水平的变化，结果表明，NACT 后CD4+（2.5 倍）、CD8+（2.5 倍）和颗粒酶B+（2.5 倍）细胞显著增加，而Foxp3+细胞数量没有变化，提示NACT 对活化T 细胞的募集或扩增与Tregs的作用不同［21］。

在一个由26名配对患者（NACT 治疗前后）组成的队列研究中，NACT 后上皮内TILs 的CD3+、CD8+、CD20+和PD-1+显著增加，CD4+T 细胞密度有增加趋势，而上皮内Foxp3+和IDO-1+细胞在NACT 后无明显变化。研究描述了NACT 的三种反应模式，其中最初具有高免疫标记物水平的肿瘤在NACT 后表现出更高的表达；具有初始低/中等水平，其增加模式与第一种类似；无TILs的肿瘤通常在NACT 后仍然保持阴性［21，24］。这些研究结果证实了NACT对肿瘤微环境的影响是可变的。

然而，关于新辅助化疗导致TILs显著升高的说法并不一致。在一项针对54 例HGSC 患者的研究中，Bohm S等分析了25例配对患者化疗后T细胞密度的变化，NACT 前后CD8、CD4、CD3、CD45+TILs 密度均无显著性差异，在NACT 治疗后有良好疗效的组别中，Foxp3+ TILs 明显减少，PD-1、CTLA4和PD-L1等共调节分子表达增加。研究还证实，尤其是在对NACT 反应良好的患者中，随着CD4+T 细胞IFN 生成的增强，T 细胞活化增强，抗肿瘤Th1 基因的信号增强［25］。这些研究强调了NACT 对肿瘤免疫环境的重要影响，在选择患者进行免疫治疗时，应考虑治疗后肿瘤的免疫状况。

三、新辅助化疗后TILs对预后的影响

评估NACT 后免疫亚群的研究均未发现CD4+、CD8+或CD3+ TILs 水平与预后的相关性［5，21，25］。对CD8+/CD4+ TILs 比值的研究显示出矛盾的结果，Polcher 的研究证实可以改善预后，但Bohm S 的研究结论与之相反［21，25］。Wouters MC 等比较了晚期高级别浆液性癌（high-grade serous carcinoma，HGSC）患者（134例手术治疗，121例新辅助化疗）中TILs的浸润情况，研究发现，CD8+TILs 是预示可行彻底的肿瘤细胞减灭术的唯一指标，而CD27+CD8+TILs的患者，即使是不彻底的肿瘤细胞减灭术，预后也相对较好。在接受新辅助化疗的患者中，NACT后CD8+以及CD27+细胞浸润均与预后无明显相关性［5］。

CD8+/CD4+/CD3+TILs 的患者新辅助化疗后预后并没有得到明显改善，可能的原因在于协同抑制分子的共同上调［23-25］。研究表明，约2/3 PD-L1 阴性的TILs患者在NACT后PD-L1呈阳性，而化疗后sTILs 水平的升高更多见于PD-L1 阳性的患者，证明这种免疫抑制机制的激活是化疗期间对免疫刺激的调节反应［23］。PD-1是表达于T细胞上的免疫抑制分子，它可以阻止T细胞进入细胞周期，并可产生细胞因子［26］，其配体PD-L1上调后可引起T细胞凋亡［27］，使肿瘤细胞获得免疫逃逸［28］。因此，PD-1、CTLA4 或其他协同调节分子同时增加免疫抑制信号，从而抵消了化疗刺激T细胞募集的潜在有益效果［25］。

Foxp3 是一种转录因子，是当前鉴定调节性T细胞最常用的分子标志物，而且参与了Tregs 细胞的分化和功能。NACT 后Foxp3+T 淋巴细胞减少的患者预后较好［21，25］。Polcher M 等证实了NACT 后颗粒酶B+T细胞显著增加与PFS的改善有关［21］。颗粒酶B 是一种颗粒相关蛋白，表达于NK 细胞以及活化的CD8+CTLs细胞中，颗粒酶B+/Foxp3比值的增加与PFS 呈正相关［21］。虽有研究发现，NACT 后CD79+B 细胞、CD138+浆细胞和CD68+巨噬细胞表达无差异，且与预后无明显相关性，但NK 细胞、中性粒细胞、B 细胞或巨噬细胞等免疫细胞水平在NACT前后的变化，其具体特征仍尚不清楚［24］。

迄今为止所产生的数据大多基于使用不同新辅助化疗方案、抗体、标记物和截点的小型异质性回顾性研究，上述因素可能是不同研究结果之间存在差异的原因，从而导致了明确卵巢癌化疗后样本中免疫亚群对预后的影响较为困难。此外，目前尚无标准化的方法来评估卵巢癌中TILs 水平，上皮内/间质/肿瘤内/瘤体周围TILs 之间的差异仍不十分明确［29］。相比之下，在乳腺癌中，国际TILs工作组已经发布了一种推荐的评估方法，其中间质TILs和上皮内TILs 都被明确定义并作为独立参数进行评估［30］。其他对结果产生影响的因素还包括样本固定方案、最后一个化疗周期和样本获取之间的时间间隔、疾病分期和组织学等。如何更全面地评估原发性卵巢癌和多发性腹膜转移瘤解剖上不同区域的免疫参数，对于阐明肿瘤异质性如何导致化疗前后免疫状况的差异至关重要［29］。

尽管研究结果之间存在一些差异，但现有的研究数据支持，NACT 后残留肿瘤中免疫细胞与效应细胞的平衡与预后密切相关。例如，高水平细胞毒性TILs 与低水平Foxp3+ TILs 二者的结合，通常与患者的生存率提高有关［29］。未来将进一步研究TILs各个亚群在免疫应答中的作用机制，探索相关免疫参数在卵巢癌诊断和NACT后的预后价值。

四、NACT后的免疫治疗策略

目前EOC的治疗仍然是一个重大挑战，迫切需要新的治疗策略来降低晚期患者的高复发率和死亡率。整合有关卵巢癌NACT 局部免疫反应的信息可获得更有效和个性化的免疫治疗策略。EOC中进行的免疫治疗试验是在未经选择的、经过大量预处理的潜在免疫衰竭患者中进行的，结果只有适度的应答率［31］。以导致复发的最小残留病灶为目标，利用宿主免疫系统对选定的患者进行初始治疗后的免疫维持治疗，可能是更合适的治疗方式［29］。

越来越多针对T 细胞和巨噬细胞的各种协同调节分子（IDO、TIM3、LAG3、CCR2、CSF1R、GITR、OX40、ICOS）的免疫疗法正在开发中［29］。未来的试验应更侧重于评估个体化的免疫治疗策略，根据NACT 后的肿瘤免疫状况来选择辅助治疗［29］。例如，NACT 后肿瘤微环境中淋巴细胞丰富、PD-L1阳性的患者，可给予PD-1/PD-L1 抑制剂作为维持治疗；NACT 后淋巴细胞丰富、PD-L1 阴性患者，免疫治疗可根据其他共抑制分子（TIM3、LAG3、IDO）或共刺激分子（OX40、GITR）的表达做出调整；治疗后淋巴细胞缺乏、PD-L1阳性的患者可采用PD-1/PD-L1 抑制剂联合疫苗或抗CTLA4 辅助治疗，以增强内源性TILs的运输和活性，从而最大限度地提高治疗效果［29］。

EOC是典型的化疗敏感性肿瘤，大多数肿瘤细胞可以通过化疗来消除。然而，真正完全的病理反应＜5%，因此，NACT后几乎均存在有活性的肿瘤组织。越来越多的研究证实，从接受新辅助化疗的患者中获取配对序列研究样本是可行的［25，32-34］。然而，对化疗后每隔一段时间取出的卵巢癌样本进行生物标记分析是一个巨大的挑战，这需要研究人员与外科医生和病理学家密切合作，以优化肿瘤样本的选择、处理和固定［29］。

评估NACT 对免疫相关基因谱的影响有助于对残留肿物的免疫背景进行更有效的解读，将来可以在新辅助化疗试验中单独研究，也可与新的靶向和免疫治疗方案相结合。此外，为了加强免疫和细胞毒性疗法之间的协同作用，新辅助化疗方案需要进一步优化，确定所用药物的最佳时机和顺序至关重要。无论是卡铂还是紫杉醇，均不能诱导免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD），是否可以通过加入经典的ICD诱导剂（如阿霉素或环磷酰胺）来增强新辅助化疗的免疫调节效应，有望成为一种有前景的方法。

五、结语

卵巢癌中TILs 的聚集是影响生存的重要因素。目前已有研究表明，新辅助化疗可通过增加CD8+T细胞、减少Tregs 和改变免疫共抑制分子如PD-L1或CTLA4的表达来破坏肿瘤的免疫微环境。将来需要在更大的人群中进行进一步的研究，以明确NACT 后肿瘤床上发生的免疫变化。考虑到肿瘤对NACT 的免疫反应，在初次治疗后，根据免疫亚群的类型和化疗后肿瘤中确定的共调节分子的表达，将EOC患者的维持治疗进行分层管理，从而实现真正的个体化治疗。NACT 后根据肿瘤免疫状况，结合适当的维持性个体化免疫治疗药物，可能消除微小残留病灶，改善晚期卵巢癌患者的预后，有望成为新的有希望的治疗方法。