高效液相色谱测定季铵盐复合消毒液中的苯扎溴铵和邻苯二甲醛

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(河南医学高等专科学校药学系化学教研室,郑州 451191)

邻苯二甲醛(OPA)是双醛基芳香化合物,具有腐蚀性小和毒性低等优点,是医院消化内镜首选消毒剂[1]。文献[2]研究了4种市售OPA消毒剂的细菌芽孢杀灭效果,其中3种OPA消毒剂在作用300 min的杀灭对数仍不理想。文献[3]将苯扎溴铵作为增效成分,与OPA复配后制备了季铵盐复合消毒液,改变了单一OPA作用时杀灭细菌芽孢速度慢的缺点。文献[4]认为复合消毒液中的苯扎溴铵能够附着在菌体表面,改变细胞壁和细胞膜的通透性和渗透压,使OPA更易进入细胞内部,从而增强了细菌芽孢杀灭效果。苯扎溴铵和OPA的配比会影响这种复合消毒液的杀菌效果,因此,需要建立一种可以同时测定这两种物质含量的方法,以控制生产过程中两者的含量和配比。但是,由于复合消毒液的基质较为复杂,目前还未见可供参考的国家标准和文献方法。

现行的《消毒技术规范》[5]采用滴定法测定苯扎溴铵的含量,但没有规定OPA的测定方法;文献[6]中采用滴定法,分光光度法和液相色谱法测定了OPA含量。其中,滴定法和分光光度法仅适用于简单基体消毒剂中单一组分含量的测定。基于先分离后定量的高效液相色谱法(HPLC)是测定复合消毒剂中多组分含量的可靠方法[7]。目前国外文献多采用有机试剂将OPA衍生后,再用HPLC对其进行测定[8],该方法灵敏度高,适用于医疗产品表面残留的痕量OPA测定,但存在衍生步骤复杂,精密度和回收率较差等缺点。市售消毒产品中OPA含量一般在0.50%(质量分数)以上,季铵盐杀菌液中苯扎溴铵的质量浓度通常为500 mg·L-1,含量均较高,属于微量分析,无需进行衍生,直接采用HPLC即可满足测试要求。因此,本工作采用HPLC测定了季铵盐复合消毒液中的苯扎溴铵和OPA含量,以期为生产过程中苯扎溴铵和OPA含量的监控提供技术参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Alliance 269型高效液相色谱仪;CT 15RE型高速离心机。

苯扎溴铵标准溶液:10.9 g·L-1。

苯扎溴铵标准储备溶液:2.0 g·L-1,量取苯扎溴铵标准溶液1.83mL,用水定容至10.0mL。

OPA标准储备溶液:2.0 g·L-1,称量0.2 g OPA标准品,用水溶解并定容至100.0mL,超声辅助混合均匀。

混合标准溶液系列:取适量苯扎溴铵和OPA标准储备溶液,用水稀释,配制成苯扎溴铵和OPA质量浓度分别为10.0,20.0,50.0,100.0,200.0,400.0,800.0 mg·L-1的混合标准溶液系列。

OPA标准品纯度不小于98%;甲醇为色谱纯,其他试剂为优级纯或分析纯;试验用水为去离子水。

1.2 仪器工作条件

Symmetry C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为体积比为1∶1的0.02 mol·L-1的乙酸-乙酸铵缓冲溶液(pH 4.5)和甲醇,等度洗脱;色谱柱温度30 ℃;检测波长263 nm;进样体积10μL;流量1.0mL·min-1。

1.3 试验方法

取1.0mL样品于10mL容量瓶中,用流动相定容至刻度,涡旋混合5 min后过0.45μm滤膜,滤液按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长

为了得到苯扎溴铵和OPA的最佳检测波长,试验选择在190～400 nm内,对混合标准溶液进行紫外-可见光谱扫描,结果见图1。

图1 苯扎溴铵和OPA的紫外-可见吸收光谱图Fig.1 Absorption spectrum of UV-Vis of benzalkonium bromide and OPA

由图1可知:OPA的特征吸收波长在263 nm附近;苯扎溴铵的特征吸收波长在220,263,300 nm处。其中263 nm为苯扎溴铵和OPA的共同特征波长,且此处的背景吸收和噪音干扰较小、检测灵敏度较高且抗干扰能力较强,故选择在263nm处测定苯扎溴铵和OPA。

2.1.2 色谱柱

在色谱柱选择方面,美国药典[9]和中国药典[10]分别推荐采用氰基柱和C18色谱柱分离苯扎溴铵,而氰基柱和C18色谱柱都可用来分离OPA。因此,试验考察了分别采用氰基柱和C18色谱柱作为色谱柱时对苯扎溴铵和OPA色谱分离效果的影响。结果发现:以氰基柱为色谱柱分离时,苯扎溴铵保留时间的重现性不好,测定结果易出现假阳性;以C18色谱柱分离时,苯扎溴铵和OPA色谱分离效果均较好,故试验选择采用C18色谱柱分离季铵盐复合消毒液中的两种有效成分。

2.1.3 流动相组成

苯扎溴铵是极性阳离子表面活性剂,易与C18色谱柱固定相中残存的硅醇基形成氢键,造成色谱峰拖尾现象。文献[11-14]在流动相中加入庚烷磺酸钠离子对试剂,通过磺酸根阴离子与季铵盐阳离子缔合成中性离子对改善了苯扎溴铵在C18色谱柱上的保留性能,但是离子对试剂会在色谱柱的固定相上产生不可逆吸附,损伤色谱柱。经过反复试验,试验选择体积比为1∶1的乙酸-乙酸铵缓冲溶液(pH 4.5)和甲醇为流动相,其中的乙酸根阴离子可与季铵盐阳离子形成中性化合物,增加苯扎溴铵在色谱柱上的保留;而乙酸-乙酸铵缓冲溶液可保持流动相的酸度稳定和一定离子强度,从而达到改善目标物峰型,减少色谱峰拖尾的目的。

优化后的色谱条件见1.2节,按此条件得到的样品和混合标准溶液的色谱图见图2。

图2 混合标准溶液和样品的色谱图Fig.2 Chromatogram of mixed standard solution and sample

由图2可知:在优化的色谱条件下,混合标准溶液在10 min内即可达到基线分离,OPA和苯扎溴铵的色谱峰峰形对称且无拖尾现象,保留时间分别为4.3,7.1 min。样品中的苯扎溴铵和OPA也得到了基线分离,且其保留时间与混合标准溶液的基本一致(相对偏差小于1.0%)。

2.2 标准曲线和检出限

按照仪器工作条件对混合标准溶液系列进行测定,以苯扎溴铵和OPA的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果发现,苯扎溴铵和OPA标准曲线的线性范围均为10.0～800.0 mg·L-1,线性回归方程分别为y＝8.730×103x＋6.820×102和y＝2.750×104x＋1.310×103,线性相关系数分别为0.999 0,0.999 5。

按照仪器工作条件分别对混合标准溶液和加标样品空白进行测定,以3倍信噪比(S/N)计算苯扎溴铵和OPA仪器检出限和方法检出限,所得结果分别为3.0,2.0 mg·L-1和5.0,3.5 mg·L-1。

2.3 样品分析

按照试验方法对3种季铵盐复合消毒液样品进行测定,每个样品平行测定7次,计算测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表1。其中,3种季铵盐复合消毒液样品中OPA的标示值为0.35%～0.55%,苯扎溴铵的标示值为不小于330 mg·L-1。

取10mL样品于100mL锥形瓶中,分别加入苯扎溴铵标准储备溶液0.82,1.64,4.92mL和OPA标准储备溶液1.0,2.0,5.0mL,混合均匀后,转移至100mL的容量瓶中,用流动相稀释至刻度,按照仪器工作条件测定,每个浓度水平平行测定3次,计算低、中、高等3个浓度水平的回收率,均平均值,所得结果见表1。

表1 样品分析结果(n＝7)Tab.1 Analytical results of samples(n＝7)

由表1可以看出:样品中的苯扎溴铵和OPA的测定值与标示值相符;苯扎溴铵和OPA测定值的RSD均小于1.0%;苯扎溴铵的回收率为93.7%～95.2%,OPA的回收率为94.5%～98.5%。该方法选择HPLC同时测定季铵盐复合消毒液中的苯扎溴铵和OPA含量。该方法前处理简单、精密度和准确度均较高,适用于季铵盐复合消毒液产品中苯扎溴铵和OPA含量的同时测定。