褶皱臂尾轮虫抗逆性作用机制研究进展

邹京京，赵文

(大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁省水生生物学重点试验室，辽宁 大连 116023)

轮虫隶属于轮虫动物门，是盐湖中尤其是盐度低于30的盐湖生物群落组成中的重要类群之一，在淡水水域生态系统能量流动及物质循环中也是不可或缺的一部分。目前，世界范围内广泛生境中均有其分布的踪迹，因其自身具有众多的独特优势，且对环境表现出高度适应性，故对其生物学、生态学进行研究具有重要价值。

褶皱臂尾轮虫Brachionusplicatilis是内陆盐水种轮虫中的典型代表，其体形微小，通常被甲长为233.1～277.6 μm，被甲宽为170.3～201.7 μm, 是广泛应用于水产动物幼体的优质开口活饵料[1]。褶皱臂尾轮虫对环境抗逆性较强，在水生生物学、生态毒理学、生物的系统发生与进化研究方面也已成为重要的模式生物。因此，对褶皱臂尾轮虫抗逆性及其作用机制进行研究与探讨具有重要意义。为适应外界不良的环境条件，褶皱臂尾轮虫已进化出各种不同的生活史对策，以提高自身适应度。一般情况下，褶皱臂尾轮虫在自然界行孤雌生殖，但面对环境胁迫，轮虫即采取应激反应，从无性生殖转化成有性生殖，此阶段轮虫母体会产生休眠卵以抵御高温、低温或干燥等各种不良环境条件。

早期学界对褶皱臂尾轮虫的相关研究大多集中在其分类学和养殖领域，随着分子生物学的发展，褶皱臂尾轮虫抗逆性的生态学研究逐渐发展到研究其生理适应的内在机制及生存进化等分子层面。目前，温度、盐度和紫外线等环境因子对褶皱臂尾轮虫种群生存及生长发育的影响已有报道，但关于褶皱臂尾轮虫应对环境胁迫作用机制的研究尚不多见，尤其有关褶皱臂尾轮虫抗逆性分子机制方面鲜有报道。本研究中，对褶皱臂尾轮虫抗逆性研究情况进行了综述，旨在为褶皱臂尾轮虫的培养及应用提供参考。

1 褶皱臂尾轮虫对非生物因素的抗逆性作用

1.1 温度

温度对褶皱臂尾轮虫的生长有着重要影响。不同温度下，轮虫种群数量达到高峰的时间不同，但在一定的温度范围内，随着温度升高，种群密度会出现先升高后降低的趋势[2]。由于温度对轮虫新陈代谢、生长、发育等起到决定性作用，从而能够显著影响轮虫的种群增长及种群密度。

生物应对各种环境压力时,体内相关蛋白的表达是关键的调控机制。作为分子伴侣的热休克蛋白家族，拥有十分庞大的种类数目，在帮助生物抵御高温、低温等其他一系列生物和非生物胁迫中发挥了重要作用[3]。已有研究表明，轮虫在受到温度胁迫时，体内的典型编码热休克蛋白Hsp40、Hsp60、Hsp70和Hsp90等基因表达会受到显著影响[4-5]，以此来提高其对应激环境的胁迫耐受性，但在不同的温度诱导下热激蛋白家族基因表达具有差异[6]，这可能与其耐热性有关。在高温(37 ℃)和低温(10 ℃)胁迫下，褶皱臂尾轮虫热休克蛋白家族中Hsp20基因表达量随时间显著升高，并在暴露90 min后达到最高水平，表明Hsp20是响应温度胁迫的重要基因[7]。由此可见，褶皱臂尾轮虫的耐热性与体内耐高温相关蛋白的种类及数量息息相关。

除了热休克蛋白，轮虫还可通过体内其他种类蛋白和脂质的合成来提高其耐低温能力。Lubzens等[8]研究发现，在低温期间，轮虫体内合成的94 ku蛋白质及包括二十碳五烯酸在内的大量脂质，有助于其适应特定的低温条件。Assavaaree等[9-10]研究发现，将褶皱臂尾轮虫在15 ℃温度条件下驯化96 h，或在低温保存期间定期更换培养液，其耐低温能力会相对提高。

1.2 盐度

褶皱臂尾轮虫是世界性分布的盐水种。有学者指出，褶皱臂尾轮虫是一种随渗生物，并推论其耐受盐度的低限小于1[11]，这也在北京牛口峪调查中得以证实，在盐度小于0.5的水体中发现有褶皱臂尾轮虫的分布(赵文，未发表资料)。褶皱臂尾轮虫在盐度2～50范围内均能生长并进行繁殖，生长繁殖的适宜盐度为10～30[12]。当盐度突然发生较大幅度变化时，轮虫耐受力降低[13]。盐度突变的盐差越大，褶皱臂尾轮虫的适应能力(适应所需时间和存活率)越弱[14]。在摄入相同的食物能后，褶皱臂尾轮虫对盐度胁迫的适应将会表现出不同的生态对策，在低盐度下，由于其淡水起源性，调节渗透压的能量少于高盐度下，因此，会出现生殖率相对较高的现象；而在高盐度下，轮虫将更多的能量用于维持内环境稳定，表现为有较高的生命周期[15]。除此之外，轮虫在高盐度下，体内谷胱甘肽硫转移酶(GST)表达量上调[16]，从而将高盐胁迫诱导产生的有毒害作用的活性氧还原，以减少细胞结构与功能的破坏，保护机体免受氧化损伤，延长了轮虫寿命。

褶皱臂尾轮虫是广盐性种类，为了更好地了解褶皱臂尾轮虫受环境胁迫的生态机理，王珊等[17]研究了温度和盐度对褶皱臂尾轮虫复合类群中的3种轮虫休眠卵体积变化的影响，发现温度、盐度及其交互作用对轮虫休眠卵体积变化的影响显著，对于两种相似的同胞物种B.plicatilisMüller和B.plicatilisYamamoto休眠卵来说，其对盐度的变化较温度更为敏感，较大的休眠卵只出现在轮虫较为适应的环境中。在极端的温度和盐度条件胁迫下，褶皱臂尾轮虫的休眠卵体积较大，这可能是褶皱臂尾轮虫对极端环境的一种适应调节[18]。相对于其他轮虫，盐度对褶皱臂尾轮虫休眠卵孵化的影响也十分显著[19]。在孵化期内仍处于休眠状态的卵，当环境条件改变后，可有效促进其孵化，例如盐度的变化，尤其在从高盐度向低盐度转移时效果最为明显[20]。在盐度4～20下培养的褶皱臂尾轮虫种群中有性个体比率最高，在此范围外则比率急剧降低，这表明适宜的盐度范围有利于有性生殖发生[21]。由此可见，褶皱臂尾轮虫休眠卵在不良环境如盐度胁迫时，会利用胚胎发育和自身防御间的能量分配机制来维持其内环境稳态。

1.3 pH

pH的高低对轮虫生存和繁殖等有着重要影响[22]，有关适合褶皱臂尾轮虫繁殖的pH报道不尽相同。周竹君等[23]研究发现，褶皱臂尾轮虫在不同pH下的增殖速率有较大差异，在pH为6左右时，具有较低的增殖速率，而随着pH不断升高，其增殖速率迅速提高，在pH达到9时出现最大增殖速率，随着pH的升高则会使其增殖量下降。在土池轮虫生产实践中，也有高pH抑制轮虫增殖的现象出现。而根据Snell等[24]和徐海龙等[14]的研究，褶皱臂尾轮虫最适生长繁殖pH范围为7.5～8.5。由于轮虫对非生物因子的响应受其相对应栖息地理化条件的影响[25]，其对pH的耐受性与其原栖息地环境中pH高低有着十分密切的联系[15]。陈婕等[26]以褶皱臂尾轮虫为受试生物，研究了pH对其休眠卵孵化的影响，结果表明，同样当pH为9时，褶皱臂尾轮虫休眠卵产量最大，pH升高或降低均会对其产量产生影响，过高的pH不利于其孵化，原因可能是轮虫休眠卵致密的外壳虽抵御了捕食者消化酶的作用及外界不良环境，但同时自身的萌发也受到了抑制，而适宜的温度、盐度和pH等不同环境刺激对其孵化有促进作用。

1.4 紫外线(UV)辐射

地球表面的UV-B(波长280～320 nm)会对包括无脊椎动物在内的许多生物的生长、发育繁殖造成负面影响，水生生物受UV-B辐射的影响较大[27]。低剂量紫外线照射会使褶皱臂尾轮虫自身的细菌携带量减少，但不会对轮虫的运动能力、摄食活性和脂肪酸组成造成显著影响[28]。但当紫外线照射时间延长时，一方面轮虫为尽量减少受到紫外线辐射，会趋向于水下活动[29]；另一方面，轮虫具有运动和摄食功能的器官纤毛受到损害，其运动和摄食能力受到抑制[30-31]，进而影响了轮虫的寿命及繁殖。此外，紫外线照射可明显增加轮虫体内脂肪氧化的速率，这表明由UV辐射引起的轮虫寿命减少可能是通过脂质过氧化物的产生来介导[32]。另有大量研究发现，UV-B会减缓浮游动物的发育速度，高剂量UV-B辐射会显著降低轮虫存活率及雌体抱卵率，甚至造成其种群灭绝[33-34]。紫外线也能对浮游动物的DNA造成损害[35]。褶皱臂尾轮虫种群繁殖受到抑制可能是由于其基因型受到改变所致。

1.5 重金属、有毒物质等不利因素

(1)对轮虫的氧化胁迫。对于氧化胁迫，生物体已经进化出了特定的机制，轮虫体内的酶类和非酶类物质可帮助其抵御这一不利因素。Han等[36]探究了暴露于一定浓度Cu2+下轮虫体内抗氧化酶对其氧化效应的应激机制，结果表明，在浓度为0.24 mg/L CuCl2诱导12 h和24 h后，轮虫体内活性氧(ROS)水平上升，谷胱甘肽抗氧化系统开始响应，谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活性显著增加，以保护机体免受氧化损伤；而还原型谷胱甘肽(GSH)含量无显著变化，甚至12 h后在高浓度的Cu2+中水平降低。酶介导的抗氧化机制会根据年龄或生命阶段而变化，非酶防御将在降低ROS水平中也起到重要作用[37]。因此，细胞内ROS水平与GSH间无显著相关性，这可能是因为GSH起到金属螯合剂的作用，作为不同防御机制的功能反应之一。褶皱臂尾轮虫在四溴二苯醚-47(BDE-47)和十溴化二苯醚-209(BDE-209)这两种多溴联苯醚诱导下，均使卵巢细胞内产生过量ROS，当褶皱臂尾轮虫受到这两种多溴联苯醚氧化胁迫时，抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶基因表达均被激活，同时细胞间钙离子(Ca2+)和钙调蛋白(CaM)mRNA表达量增加，这表明可通过基于Ca2+信号通道的氧化应激作用机制的调控，达到消除或减弱氧化胁迫的作用[38]。

(2)对轮虫抗逆蛋白表达的影响。轮虫世代时间短，对水体重金属、有毒物质敏感性高，是进行毒理试验的理想模式生物，在对有毒污染物的毒性评估方面具有较大优势。褶皱臂尾轮虫对Pb2+、Cd2+、Hg2+3种不同离子耐受性有差异，其中对Pb2+的耐受性最强，对Hg2+的最弱[39]。当生物体暴露于低水平毒物中一段时间后，体内的热休克蛋白会作为应对胁迫的一种防御机制定向表达。褶皱臂尾轮虫体内胁迫蛋白Hsp60在受到铜离子和三丁基锡的诱导后表达量发生变化，且在铜离子对轮虫的LC50为5% 时，轮虫Hsp60基因的表达量最大[40]。除了热休克蛋白外，有关金属硫蛋白的表达和DNA损伤等情况的研究也将对揭示重金属复合污染对轮虫的作用的分子机理有所帮助[41]。

(3)对轮虫繁殖、生长的影响。重金属离子胁迫和有毒物质也可对褶皱臂尾轮虫的繁殖、生长造成一定影响。Pb2+、Cd2+、Hg2+对褶皱臂尾轮虫的24 h LC50分别为2.83 mg/L、2.07 mg/L、4.5 μg/L[39]。特定毒物孔雀石绿、高锰酸钾和甲醛对褶皱臂尾轮虫的游泳速度、活动能力影响较大，即随着毒物浓度升高，游泳行为受到抑制，死亡率上升[42]。敌百虫和久效磷两种有机磷农药对褶皱臂尾轮虫孵化率影响也较大，随有机磷农药浓度升高，轮虫存活率及轮虫卵的孵化率降低，轮虫对久效磷更为敏感。久效磷和敌百虫对轮虫的安全浓度分别为0.000 6 mg/L和0.083 2 mg/L[43]。聚维酮碘对褶皱臂尾轮虫毒性效应明显，低浓度的聚维酮碘对轮虫种群增长和繁殖也有显著影响，这可能与褶皱臂尾轮虫对药物的抗逆性有关[44]。Kim等[45]在褶皱臂尾轮虫转录组中鉴定了28个细胞色素 P450(CYP)基因，并研究了它们的转录反应，表明Bp-CYP基因在响应异生素的解毒机制中起关键作用，该研究揭示了褶皱臂尾轮虫对各种化学物质暴露的分子防御机制。

2 褶皱臂尾轮虫对生物因素的抗逆性作用

2.1 捕食者

面对捕食压力时，许多猎物种类会采取表型可塑性(phenotypic plasticity)的进化策略来应对，轮虫对捕食者的可塑性反应有着重要的生态意义，一方面降低了个体在捕食风险下的死亡率[46]，另一方面增强了物种在捕食压力下的竞争能力[47]。捕食者信息素可以诱导轮虫体形改变，这可以有效提高其对捕食者的防御能力。如晶囊轮虫Asplanchionus可向环境中释放出一种水溶性的、不可分解的多肽物质，可诱导被捕食者萼花臂尾轮虫产生一对可移动的长后侧刺，且刺长随晶囊轮虫密度增加而增长[48]。萼花臂尾轮虫的防御体形可降低60%的捕食压力，使个体在捕食风险下具有更高的适合度[46]。而褶皱臂尾轮虫不具备后棘刺，被甲背面的前棘刺前端钝，在捕食者存在或捕食压力增大时，是否可通过营附着生活或降低游泳速度等行为上的可塑性反应来应对捕食风险还需进一步探讨。此外，据赵文等[15]推测，某些没有防御体形的轮虫面对捕食者时，可通过调节自身的生活史模式，由孤雌生殖转变为有性生殖，并产生休眠卵以逃避捕食者进而保存自身的基因。

在评价不同生境中的不同轮虫基因型对某一类捕食者反应规范(reaction norm)时，不可忽略基因型对个体表型可塑性的影响。在自然选择的作用下，长期处于某一较低捕食压力生境中的某种基因型轮虫，对捕食者所释放的化学信息素的反应灵敏性降低，甚至失去对其的反应能力[49]。进一步了解轮虫的遗传背景有助于更深层次阐述轮虫对捕食者可塑性反应的进化机制。此外，在关注轮虫对捕食者可塑性反应进化机制时，也应考虑可塑性所导致的代价，殷旭旺等[50]通过个体流体动力参数的评估和种群生命表动态的统计，对轮虫可塑性代价进行了定性及定量分析，进一步从物种水平上揭示了轮虫生殖代价假说的普遍性。综上所述，轮虫在面对捕食者或捕食压力时，可塑性反应是其维持生存的一种重要策略。

2.2 饵料

自然界中，生物因素或非生物因素均可能导致水生生物面临食物缺乏的状况。因此，在其生活史中，饥饿胁迫普遍存在。幼体的耐饥饿时间常用来作为评价轮虫后代质量和适合度的重要指标[51]。褶皱臂尾轮虫具有较强的耐饥饿能力[52]，在饥饿再恢复投喂的状态下，其能快速恢复类胰蛋白酶与纤维素酶活力，甚至胃蛋白酶与淀粉酶活力超出正常水平[53]。这可能是轮虫饥饿恢复投喂期间出现的补偿生长现象。此外，褶皱臂尾轮虫具有非常发达的淀粉酶、纤维素酶等酶系统[54]，因此，当食物缺乏时，其消化酶活力变化较大，褶皱臂尾轮虫会考虑将能量重新分配以抵御饥饿胁迫，如增加维持机体存活的能量，减少用于繁殖的能量，此时轮虫生殖率便会显著降低，这也是在饥饿条件下轮虫的一种生活史策略[55]。同时，褶皱臂尾轮虫储存在组织器官中的能量也会用于维持其基本的生命活动[56]。但轮虫受到饥饿胁迫再恢复投喂后, 会再次开始繁殖[57]。由此可见，由饥饿引起的繁殖期滞后，使得轮虫即使在饥饿胁迫的情况下，同样可以维持本物种的延续。

3 存在问题及展望

3.1 存在问题

对比其他浮游生物，近年来对褶皱臂尾轮虫抗逆性研究仍有一定的局限性，许多相关问题还未得到重视与解决。

(1) 褶皱臂尾轮虫复合类群抗逆性种间差异尚需研究。褶皱臂尾轮虫是存在着复杂同胞物种的复合类群，而以往对褶皱臂尾轮虫抗逆性的相关研究中，忽略了褶皱臂尾轮虫同胞物种因其在形态、生理和生态等方面存在着巨大不同[58]，所表现出的抗逆性可能会有一定程度上的差异。相关研究中对褶皱臂尾轮虫复合类群分类的研究已有报道，如Segers[59]根据前人的研究成果最终将褶皱臂尾轮虫的S-型和L-型分为两个不同的物种，并分别命名为褶皱臂尾轮虫B.plicatilisMüller(1976)和圆形臂尾轮虫B.rotundiformisTschugunoff(1921)。Gómez等[60]利用分子生物学手段，将褶皱臂尾轮虫复合类群进一步划分为LB.plicatilis、SSB.rotundiformisSS和SMB.rotundiformisSM 3大类群。随着分子生物学发展应用及传统实验生态学研究的进一步深入，褶皱臂尾轮虫复合类群中的更多种类逐渐被发现[61]，其不同物种间的形态特点存在着较大差异，而环境因子可引起褶皱臂尾轮虫复合类群中物种形态发生改变，如温度和盐度的影响[62]。褶皱臂尾轮虫复合类群同胞物种在不同环境因子影响下，是否均可通过形态的改变来适应不良环境条件，以及改变的程度是否相同，均有待进一步研究。此外，在生物因素的影响下，如面对栖息环境中的捕食者，褶皱臂尾轮虫复合类群中的不同物种的可塑性反应问题也需得到关注。捕食者对轮虫形态、行为及生活史上的可塑性方面研究尚不深入，下一步应深入研究在环境因子胁迫下，轮虫将会以何种可塑性反应降低风险，以及通过评价环境条件和遗传背景对轮虫可塑性影响及定性和定量分析可塑性导致的代价，进一步了解轮虫对捕食者可塑性反应的进化机制。

(2) 褶皱臂尾轮虫复合类群生态适应性研究尚需深化。褶皱臂尾轮虫复合类群中不同种类的轮虫对环境变化有不同的响应，L-型轮虫适应于低温条件，并对较高的盐度有耐受性，而SS-型轮虫比较适应高温、高盐度条件，SM-型轮虫则在高温、低盐度环境中较为适应，以上均与褶皱臂尾轮虫复合类群中的轮虫种类生态幅广、适应能力较强有关[63]。B.plicatilisYamamoto这一种类轮虫在混盐水体和低盐水体中分布广泛且较常见，沿海混盐水体的褶皱臂尾轮虫复合类群中不同的轮虫种类受生态因子的影响程度不同[61]。因此，在了解褶皱臂尾轮虫对环境胁迫的抗逆机制时，需进一步研究这一复合类群为何会表现出不同的生态适应差异[15]。

(3) 褶皱臂尾轮虫复合类群遗传多样性研究尚需深入。该类群中不同物种轮虫，在蛋白质或DNA上的种间差异有时往往不能在形态或生态的表型中明显体现出来[61]。但当外界环境改变时，微小的基因差异就有可能会导致其在不同环境条件下产生不同的变化。因此，褶皱臂尾轮虫作为复合类群轮虫中的典型代表，在环境胁迫状态下，可以对其体内相关调节蛋白或基因的变化规律差异等开展深入研究。

(4) 不同产地褶皱臂尾轮虫生理生态学研究亦须加强。褶皱臂尾轮虫地理分布十分广泛，也是盐湖中分布最广的轮虫，在中国沿海和广泛盐湖区域、俄罗斯西伯利亚、伊朗和土耳其等大小不一的盐湖中均有发现。学者在对中国三北地区内陆盐水水域轮虫资源调查中发现，绝大多数都为单巢目种类，臂尾轮科的种类最多，但其出现的最高盐度、pH和碱度不同，其中，以褶皱臂尾轮虫对盐度的耐受性最高，盐度上限可达214[15]。除南极外，所有大陆盐水中均以褶皱臂尾轮虫为代表种，苏联艾尔顿湖其分布的盐幅为3～250。在盐度为90的加利福尼亚莫诺湖(Lake Mono)中也发现了褶皱臂尾轮虫的存在[64]。由此可见，褶皱臂尾轮虫对环境胁迫耐受性的差异与不同的产地分布有一定关系。此外，在碱度高达147 mmol/L的苏丹西部的大达里巴湖和肯尼亚、乍得、维多利亚、奥地利、匈牙利，以及中国高碱度水体中均发现有褶皱臂尾轮虫，在澳大利亚和苏联的氯化物型水域，以及加拿大萨斯科切温和美国北达科他的硫酸盐水体中也是重要种类[65]，但在中国白城地区的低盐、碳酸盐-氯化物亚型水体中，并未检测出褶皱臂尾轮虫[15]。因此，需加强褶皱臂尾轮虫对不同水体中的阴离子变化的抗逆性问题的关注。

3.2 展望

褶皱臂尾轮虫作为饵料生物和模式生物，环境胁迫对其生态和生理有着重要影响，今后需进一步了解轮虫在自然选择过程中对环境胁迫进化出的特定适应机制，应借助分子生物学手段，就世界范围内广泛生境的褶皱臂尾轮虫遗传多样性及其适应进化机制等多方面开展深入研究。

(1) 进一步加强褶皱臂尾轮虫遗传多样性研究。不同品系的褶皱臂尾轮虫由于对其栖息地环境的长期适应性，对温度、盐度和碱度等表现出了较强的抗逆性，可通过加强其抗盐碱、耐低温等抗逆基因的研究，从分子水平上深入了解相关基因对褶皱臂尾轮虫抗逆性的调控机制，筛选出针对不同特定环境条件的褶皱臂尾轮虫品系，这对其作为饵料生物在海水鱼虾蟹类育苗技术中的合理开发应用将有所帮助。同时，大量的研究也会为开发适宜不同水产动物开口饵料需要的轮虫种类提供科学参考。

(2) 进一步在生理、生化水平上研究其抗逆性作用机制。暴露于环境污染物中的褶皱臂尾轮虫，必将在体内脂肪酸和蛋白质合成代谢等方面做出对应的调整，通过分子生物学手段选取相应的环境污染标志物指标，将会增强其在水环境生物监测中作为测试生物的应用优势。

(3) 深入探究褶皱臂尾轮虫生态适应相关基因的表达规律。包括褶皱臂尾轮虫复合类群种间和种内对应激环境适应性的差异，将会有助于其作为模式生物在生物适应性进化、生态毒理学和环境基因组学等方面的研究及应用。

综上所述，目前关于褶皱臂尾轮虫抗逆性研究还存在诸多问题，若将褶皱臂尾轮虫在各种环境胁迫下的基因表达与实验生态学测试手段相结合，进一步了解褶皱臂尾轮虫的抗逆性作用机制，对于水产养殖、环境保护和水生生物学发展具有重要意义。