肺泡Ⅱ型上皮细胞衰老与肺纤维化研究进展

张 乙，徐 洪

(华北理工大学 a.临床医学院；b. 公共卫生学院，河北 唐山 063210)

肺纤维化是多种肺部疾病的最终表现，以失控的损伤修复为主要特征，引起了炎性细胞浸润、成纤维细胞增殖、肌成纤维细胞转化，最终导致细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的过度沉积，引起肺泡正常结构和功能的破坏。肺纤维化早期诊断较为困难，无特异性的临床表现，亦无特异性的治疗手段，因此研究肺纤维化发生、发展机制与寻求新的治疗靶点，一直是肺部疾病相关研究领域的难点和热点问题。研究发现，细胞衰老是多种肺部疾病发生、发展的重要因素[1]。本文复习了近年来有关肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar type Ⅱ cells, AT2)衰老在肺纤维化发生、发展相关机制的相关文献。

1 细胞衰老可能是肺纤维化形成的核心机制之一

衰老能够引起肺内干细胞的减少、线粒体功能失调、氧化应激损伤加剧和端粒酶缩短，最终导致肺内细胞不能保持稳态平衡，是慢性阻塞性肺疾病和特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)等多种肺部疾病发生、发展的重要因素[1]。复制性衰老与端粒酶损伤有关，DNA损伤反应(DNA damage response, DDR)通过激活毛细血管扩张性共济失调突变激酶(ataxia telangiectasia-mutated gene, ATM)和毛细血管扩张性共济失调Rad3 相关激酶(ataxia telangiectasia and Rad3-related kinase, ATR)，引起p53介导的短暂增殖停滞，DNA损伤修复成功则重新进入细胞周期，修复失败则走向衰老或凋亡；过早性/应激相关衰老则与端粒长度无关，通过p16INK4a-Rb信号、p53-p21CIP1信号的活化和相应的细胞周期阻滞，或以p27信号作为靶向，以衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)为主要特点，与肺纤维化的形成关系密切[2-3]。SASP表型能够激活多种促纤维化信号，包括p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)信号和Janus活化激酶(Janus-activated kinases, JAK)信号，并导致核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信号的激活，从而引起了炎性介质如白细胞介素(interleukin, IL)、生长因子如转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)、趋化因子和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)的升高；其他与SASP有关的标记物的信号还包括纤溶酶原激活物抑制剂1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-3-kinase, PI3K)-哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号等，SASP细胞通过自分泌和旁分泌的形式促进细胞衰老的范围和程度，并引起慢性炎症的扩展，并能够引起巨噬细胞-肺泡上皮细胞-成纤维细胞间促纤维化信号的交互作用[4]。因此，以SASP靶蛋白和靶信号作为治疗方向，或上调组蛋白去乙酰化酶(sirtuin 1或6)的表达，或利用特异的靶向微小RNA(micro RNA, miRNA)，或利用二甲双胍激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)信号，有可能通过拮抗细胞衰老，从而改善肺功能、延缓肺纤维化的进展，即细胞衰老信号可能是抗肺纤维化治疗的靶向之一[4]。

然而值得注意的是，细胞衰老可能对器官纤维化起到正、反两反面的调节作用。在IPF、四氯化碳诱导的肝纤维化和多囊肾等一些衰老相关的疾病中发现，衰老相关成纤维细胞形成SASP并分泌少量的TGF-β1，促进邻近成纤维细胞转化活化为纤维化相关成纤维细胞，但敲除p53基因或阻断衰老途径后，器官纤维化的进展反而加剧，表现为剧烈的DNA损伤，不可控的细胞增殖和凋亡，ECM分泌紊乱[5-6]。进一步研究则发现，虽然衰老相关成纤维细胞与纤维化相关成纤维细胞均可表达肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)且具有典型的肌成纤维细胞超微结构和收缩特性，但是衰老相关成纤维细胞与ECM有关的mRNA缺失表达，而蛋白水解酶、胶原酶、弹性酶和基质溶酶等表达水平升高，对邻近的纤维化相关成纤维细胞增殖和迁移具有一定的抑制作用[7-8]。

虽然目前尚无细胞衰老与尘(矽)肺纤维化发生、发展直接相关的文献报道，但衰老相关因素与尘(矽)肺纤维化进展关系密切。流行病学调查显示，尘肺病患者接尘年龄与发病工龄呈负相关，即随着接尘年龄的增加，发病工龄相应缩短[9]。课题组前期研究也发现，与衰老有关的标记物，如p21、磷酸化组蛋白H2AX(phosphorylated histone H2AX, γH2AX)随大鼠染尘时间增加而增高[10]。其他研究也发现，支气管一次性灌注构建的小鼠模型肺组织中，也存在着γH2AX表达水平的上调[11]。与衰老有关的自噬、内质网应激和线粒体应激等信号在矽肺发生、发展中的异常活化，通过调节p53及其下游信号，参与了对慢性炎症、胶原沉积、肌成纤维细胞分化和上皮间质转化等促纤维化信号的调控[12-13]，即在尘(矽)肺纤维化进展中，也可能伴随了衰老信号的激活。

2 肺泡Ⅱ型上皮细胞的衰老加速了肺纤维化进程

已知AT2在维持肺内稳态中具有重要意义，其主要功能包括增殖成为新的AT2细胞、向AT1细胞分化、分泌表面活性物质，具有肺水转运功能和免疫功能，因此部分文献认为AT2细胞的功能异常是肺纤维化形成的重要因素，自噬、内质网应激和线粒体应激导致DDR被激活，除了可以导致AT2细胞的凋亡以外，同时能够诱导AT2发生衰老，形成SASP表型，是肺纤维化重要的驱动因素[14]。

已经证实AT2细胞衰老多伴有其他表型的转换，与内质网应激关系密切。在IPF患者以及博来霉素小鼠模型中，均发现了衰老相关指标的上调，且来源于博来霉素小鼠的原代AT2细胞β半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal)染色阳性，分泌型焦磷酸蛋白(secreted phosphoprotein, SPP)1和MMP2等公认的SASP指标表达均增加，且表现出上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)表型，予以抗衰老药达沙替尼(dasatinib)和懈皮素(quercetin)则能够显著抑制博来霉素介导的细胞衰老和纤维化病变[15]。内质网应激关键蛋白葡萄糖调节蛋白(glucose regulated protein, GRP)78基因敲除小鼠的AT2细胞表现出内质网应激损伤、凋亡、衰老和分化能力下降等表现，并伴随着TGF-β1信号的异常激活，提示内质网应激是衰老和IPF之间的主要联系[16]。另有研究也发现，细胞分裂周期蛋白(cell division cycle 42, Cdc42)的缺失表达能够导致AT2细胞不能分化为AT1细胞，即无法形成新的肺泡结构，且机械张力的增高导致AT2细胞TGF-β信号的异常激活，驱动衰老小鼠发生“外周向中心发展”的进展性肺纤维化，该研究将肺泡再生受损、机械性张力和进展性肺纤维化建立了联系[17]。

该研究还利用单细胞测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)技术将AT2细胞区分为两种亚群，其中与Cdc42表达缺失的基因与IPF发相关靶基因有类似的特点，多集中在肌动蛋白骨架的调节和黏着斑信号[17]，与肌成纤维细胞分化关系密切[18]。针对3例对照和6例IPF患者肺组织的scRNA-seq研究发现，存在不同作用类型的肺上皮细胞，其中命名为“不确定(indeterminate)”阶段的肺上皮细胞伴随着TGF-β、p53、Wnt等信号的异常激活[19]。来源于博来霉素小鼠肺组织的scRNA-seq研究也发现，老龄鼠AT2细胞炎症相关指标上调，脂质代谢指标下调[20]。另有研究显示，AT2分化为AT1细胞在生理与病理状态下机制不同，并与邻近成纤维细胞有关[21]。上述研究提示，AT2细胞可能具有多种亚群，除了分泌肺泡表面活性物质、分化为AT1细胞外，其可能还具有其他类型的作用，在病理状态下也可能具有不同的反应。

3 肺泡Ⅱ型上皮细胞的衰老可能是肺纤维化壁龛形成的重要因素

肺内干细胞主要包括基细胞(还包括Clara细胞)，以表达转录因子肿瘤蛋白63(tumor potein 63, Trp63)、细胞角蛋白5、平足蛋白(podoplanin)等为主要特征，可自我更新并分化为气道基细胞、纤毛细胞和分泌细胞，对于维持气道上皮完整性具有重要意义[22]。而AT2细胞作为肺内干细胞，与壁龛细胞(成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞)、ECM和来源于壁龛细胞的可溶性因子形成的干细胞壁龛共同调节了肺内稳态[23]。基于肺部分切除术模型，能够发现血小板源性生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)α阳性表达的肺成纤维细胞作为肺壁龛细胞，对于AT2细胞对急性肺损伤的修复具有重要意义，如果阻断了PDGFα阳性表达的肺成纤维细胞相关信号，则影响AT2细胞的增殖和修复功能；体外培养也发现，与成纤维细胞共培养的AT2细胞更容易产生克隆性增殖，并可向AT1细胞分化[23]。因此肺壁龛是维持肺稳态的重要微环境。

在肺纤维化进展中，AT2细胞存在衰老信号、促纤维化信号、转分化信号的异常激活，是AT2细胞具有不同的亚群的依据[18-21]，也可以认为AT2细胞在空间上和时间上多个信号的异常激活交织在一起，展现了AT2细胞不同的细胞命运。研究发现，肺泡壁龛(间充质)细胞能够对Wnt信号发生应答，以PDGFα阳性表达为特征，对于AT2细胞的生长和自我更新具有重要意义；而阳性表达Axin2的壁龛细胞则在损伤后优先分化为肌成纤维细胞，参与损伤修复/纤维化进程[24]。另外一项研究则发现，阳性表达Axin2的AT2细胞是肺内干细胞的主要亚群，能够接受来自邻近的成纤维细胞的Wnt分泌信号并保持干细胞特性，即成纤维细胞短程旁分泌Wnt促进AT2细胞的活性和增殖；当发生损伤时，AT2细胞能够自分泌Wnt信号并暂时扩大干细胞储备，并向AT1细胞分化，从而进行损伤修复[21]。在病理性条件下，ECM能够通过整合素信号驱动内源性潜在型TGF-β1信号的激活，促进AT2细胞发生EMT[25]。AT2细胞在TGF-β1诱导的EMT进程中，能够通过分泌结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)反过来通过自分泌和旁分泌形式活化成纤维细胞，从而促进了纤维化进展[26]。在对石棉肺的研究中发现，组织驻留的肺泡、支气管周和血管周巨噬细胞和单核细胞来源的巨噬细胞构成了纤维化壁龛，其中清除单核细胞来源的巨噬细胞能够有效的改善肺纤维化病变，单核细胞来源的巨噬细胞通过M-CSF及其受体信号，通过激活PDGFα从而促进了成纤维细胞的增殖，并调节不同亚群的AT2细胞，这种巨噬细胞-间质(成纤维)细胞和AT2细胞交互作用，是肺纤维化壁龛形成的重要环节[27]。课题组最近的实验结果也发现，在矽肺纤维化不同的发展阶段，AT2细胞呈现不同的特征表型，即正常情况下静息、巨噬细胞肺泡炎阶段增殖/活化、矽结节形成阶段失去原有功能(可能是衰老)，最终凋亡。且AT2细胞与巨噬细胞一样，在染尘早期即激活，可能与其邻近的成纤维细胞、ECM和巨噬细胞的交互作用形成纤维化壁龛。推测AT2细胞在空间上和时间上多个信号的异常激活交织在一起，展现不同的细胞命运，包括衰老、凋亡，以及由“抗纤维化功能”向“促纤维化功能”转变，可能是肺纤维化发生、发展的新机制之一。

综上所述，细胞衰老是肺纤维化发生、发展的重要环节。目前研究发现的与细胞衰老有关的信号和治疗靶点，在正常的肺稳态调控中也具有重要意义，对这些已知促纤维化信号的阻断反而可能会起到相反结果，因此对于肺纤维化的靶向治疗应更为精准。以AT2细胞作为靶向细胞，以拮抗细胞衰老作为治疗靶点，能够从逆转纤维化和维持肺内稳态两个方面拮抗肺纤维化的形成，可视为今后肺纤维化治疗有前景的策略之一。