HPV-DNA的整合与宫颈癌的关系

张 迪 李晓兰

(三峡大学 第二人民医院[宜昌市第二人民医院] 妇产科，湖北 宜昌 443003)

近些年，随着宫颈癌筛查的普及，发病率呈明显上升且年轻化的趋势，宫颈癌已成为女性生殖道最常见的恶性肿瘤。高危型人乳头瘤病毒(human papilloma viral,HPV)的持续感染是宫颈癌发生的主要病因。目前，有研究认为单纯的HPV感染不足以引起宫颈癌的发生，只有HPV-DNA与宫颈上皮细胞内染色体发生整合才可能引起宿主细胞基因突变导致宫颈癌[1]。HPV-DNA在宿主细胞染色体上的整合是HPV持续感染的关键步骤，是宫颈病变进展的生物学标志[2]。

1 HPV的结构与功能

HPV是一种常见的嗜黏膜、皮肤的环状双链DNA乳头状病毒，由病毒蛋白外壳和核心DNA构成，无包膜，以共价闭合的超螺旋结构、开放的环状结构、线性分子3种形式存在于细胞内。HPV-DNA可分为3个功能区，即早期转录区(early region,E区)、晚期转录区(late region，L区)和位于两段序列之间的非编码区-病毒上游调节区(upstream regulate region,URR区)，URR区也称长控制区域(long control region,LCR)。E区主要编码E1、E2、E4、E5、E6、E7、E8等7个早期蛋白，参与病毒复制、转录、翻译调控、细胞转化等活动[2]。其中，E1参与病毒DNA的复制和复制抑制；E2铰链区可激活、抑制病毒转录，反式调节病毒mRNA转录和DNA复制[3]；E1和E2区为常见病毒整合位点；E4与病毒复制及突变的发生密切相关；E5主要调节细胞转化，诱导宿主细胞DNA合成；E6、E7区为多数HPV亚型的转录起始点，协同参与病毒细胞转化及转录激活，可分别与p53、pRb抑癌基因结合形成复合体，使p53、pRb抑癌作用消失，细胞永生化，与HPV的致癌作用密切相关[4]；E8蛋白功能目前尚不明确，可能参与病毒复制。L区编码衣壳蛋白L1和次衣壳蛋白L2，对病毒结构蛋白质起结构性支撑作用。HPV的特殊生物学结构与功能在其感染或持续感染细胞中发挥重要作用。

2 HPV的整合位点及相关基因

1987年，El-Awady首次在SiHa细胞染色体13q22上KLF5和KLF12的基因间区中检测到HPV16-DNA，并提出HPV-DNA的整合观点[5]。目前，大多数学者认为，HPV在宫颈上皮细胞染色体上的整合位置为随机产生，E1、E2、E4、E5区最常见。有研究者收集国内外研究报道，共发现400余次HPV整合事件[6-7]。有研究者通过实时荧光PCR等检测方法，在宫颈病变组织中发现100余个病毒基因组的整合位点[8-9]。Hu等[10]利用全基因组测序和杂交捕获技术找到3 667个HPV在宿主细胞的整合位点，提供了HPV的病毒整合位点分布图，其中有数个或数十个基因在不同宫颈癌样本中同时存在整合位点；还提出高频整合位点，如POU5F1B、FHIT及KLF12等，并认为HPV在宿主细胞内可能呈“非随机整合”。这表明，HPV-DNA可能呈多片段基因整合。

病毒整合常发生于宿主细胞基因组的内含子和编码基因的密集区，如脆性位点附近、转录活性区、致癌基因等，以脆性位点最常见。脆性位点是人类染色体受外界刺激后易发生断裂的高度不稳定区，分罕见脆性位点(rare fragile sites,RFSs)和普通脆性位点(common fragile sites,CFSs)。Schmitz等[11]发现HPV约66%的整合位点位于(34%)或靠近(32%)脆性位点。高危型HPV-DNA主要整合到宿主细胞的染色体中，除9、18、22染色体外，其他染色体均有整合位点[12]。Pett等[13]认为HPV多整合到转录活跃区或结构简单的染色体区，如8q24、17q23.1、1p36、3q2813q22、14q32等，其中的肿瘤相关基因及其附近的位点亦具有易断裂、融合特性。常见的整合基因有FRA3B基因、FRA6C基因、FRA17B基因和c-myc、N-myc、TNF AIP2致癌基因等。基因整合位点与整合基因的确定可为靶向治疗提供理论依据。

3 HPV-DNA整合的可能致癌机制

HPV的开放阅读框E1和E2区断裂整合可引起E1、E2基因损坏或缺失，E1、E2蛋白质异常表达。E2对E6、E7的转录抑制作用下降，E6和E7大量表达并与p53、pRb抑癌基因结合形成复合体，导致抑癌作用丧失、细胞周期调节失常，细胞在G1期停滞进入无限增殖，细胞永生化，最终发生癌变[4]。病毒基因整合宿主细胞染色体发生的变化，以染色体易位、缺失、重排和非染色体损害等方式为主。染色体突变可使致癌基因激活和抑癌基因失活。HPV-DNA整合至宿主细胞染色体后，MYC和HMGA2等致癌基因过度表达，FHIT和LRP1B等抑癌基因表达下调，宫颈上皮细胞发生转化[11，14-15]。研究发现，EP300(16%)、FBXW7(15%)、PIK3CA(14%)、HLA-B(9%)和p53(9%)的基因突变与宫颈鳞癌发生有一定相关性，PIK3CA(16%)、ELF3(13%)、KRAS(8%)和CBFB(8%)的基因突变与宫颈腺癌发生有一定相关性[16-18]。Bierkens等[19]研究认为PIK3CA基因突变可能增加宫颈癌远处转移的风险。HPV-DNA的整合与宿主染色体突变有明显相关性。

4 HPV-DNA整合状态的检测方法

HPV-DNA在宫颈上皮细胞内的形态主要分为三种：游离型、整合型和二者兼有的混合型。研究发现，低级别上皮内瘤变(CIN I)的HPV-DNA呈游离状态，高级别上皮内瘤变(CIN II-III)及宫颈癌中HPV-DNA多呈整合状态，且随病变程度的加重整合率明显增加[9]。目前用于检测HPV整合的方法有：荧光原位杂交法(fluorescence in situ hybridization,FISH)、杂交捕获法(hybrid capture method,HC)、Southern印迹杂交法、连接-介导-PCR法、多重实时荧光PCR法、多重连接依赖式探针扩增法(multijunction dependent probe amplification,MLPA)及致癌基因转录子扩增法(amplification of papillomavirus oncogene transcript test,APOT)。

4.1 FISH法

FISH技术是利用探针互补性与被检标本细胞中核酸序列进行杂交，通过荧光显微镜观察，根据有无荧光信号及信号强度，了解HPV-DNA在细胞内的分布情况及定位病毒整合染色体的位置。信号呈弥散分布为游离型，点样密集分布为整合型，两者兼有为混合型[20]。

4.2 HC法

HC是唯一获得食品及药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的HPV分型检测方法。按照高危型DNA的全基因组文库设计捕获探针，DNA文库与捕获探针杂交后吸附捕获，未被捕获的DNA洗脱，洗脱DNA中如果存在整合位点，再进行测序、扩增，获得病毒整合的染色体图谱。HC的敏感度高，但设备要求及检测费用等较高，难以普及[21]。

4.3 Southern印迹杂交检测法

Southern印迹杂交经过酶切电泳图谱对酶切条带状态进行分析。当条带为环样8 kb左右的分子长度时，考虑为游离状态；当大于15 kb时，考虑为整合状态。其敏感度低，检测量大，操作较复杂，不宜大范围推广。

4.4 连接-介导-PCR法

连接-介导-PCR技术能检测整合HPV的病毒序列，可应用于HPV永生角质细胞的基因组病毒-细胞连接体及与HPV扩增相关的宫颈癌细胞系。此法与测序方法相结合，可检测整合染色体及分析病毒整合特征，是病毒早期整合阶段的检测方式，其缺点是不能对整合数量进行定量，不能对整合DNA的转录活性进行检测[22]。

4.5 多重实时荧光PCR法

多重实时荧光PCR法用不同的荧光基因团，对E6以及E2基因探针标记，收集不同基因E2/E6的基因拷贝数量，实现定量病毒。其原理主要为HPV病毒整合后使E2破坏、缺失，E6/E7过度表达，E6/E7与P53及pRb结合，抑癌作用消失或减弱，导致肿瘤发生，E2的缺失和宫颈病变程度呈正相关。多重实时荧光PCR法具有高通量和高灵敏度的优势，且可避免一定的重组样本误差，当前运用较广泛[23]。

4.6 MLPA法

MLPA法是以杂交、连接、PCR扩增为基础，在单一反应管内对不同核苷酸靶序列进行电泳分离、数据收集，监测靶序列拷贝数量的变化，分析待测核苷酸的具体定位和定量。此法具有操作简单、高通量、高灵敏度的优点，可以用于染色体的缺失与重排检测。由于待测探针为扩增对象，不适用于染色体的易位检测与单个细胞的核苷酸检测[24]。

4.7 APOT法

APOT法是基于mRNA转录的一种检测方法，可识别由游离型起源的病毒转录体以及整合型起源的融合转录体，对RNA进行测序、逆转录、扩增后分析完成病毒状态的鉴定。APOT可对E6与E7基因病毒整合位点与表达水平深入研究，敏感度较高。但因APOT法是基于RNA转录体进行检测，故其应用范围相对狭窄[25]。

5 HPV-DNA整合和宫颈癌发生的关系

HPV病毒持续感染者是发生高级别宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的高危人群。其原因可能与病毒整合后逃脱机体细胞识别清除、E2负调节蛋白缺失致抑癌作用降低相关[26]。Leyendecker等[27]研究发现HPV16-DNA的整合状态与宫颈癌临床分期、病理类型、组织学分化及预后无明显相关性。Gargiulo等[28]研究结果表明，高危型HPV多重感染发展为高级别上皮内瘤变及宫颈癌的风险是高危型HPV单一感染的4倍。另有研究发现，高危型HPV多重感染可增加宫颈上皮内瘤变的风险，但与宫颈癌发生相关性低，在宫颈癌中更常表现为高危型HPV单一感染而非高危型HPV多重感染[29]。Cheung等[30]在HPV16、18双重感染的宫颈癌中发现，HPV-DNA多为混合型，较HPV16或HPV18单一感染的整合率低。细胞基因整合位点可能存在非随机选择性及热点倾向性，故存在不同HPV基因对宿主细胞整合位点的竞争，相较于单一HPV-DNA感染，双重感染的游离率更高[31]。多重HPV感染可能并不增加宫颈癌发生的风险[32]。

目前，对宫颈HPV多重感染及多重HPV基因在宿主细胞中的整合状态如何、对宫颈病变的影响如何，尚无定论，仍有待进一步研究。

6 总结及展望

高危型HPV感染，多为一过性感染，当HPV-DNA在宿主细胞染色体中由游离型变为整合型时，HPV不易被机体清除呈持续性感染状态，极大地增加了宫颈细胞恶变的风险。HPV多重感染在宫颈上皮细胞中的整合状态及机制如何，对宫颈上皮细胞有何影响尚不明确。HPV-DNA的整合可能是HPV持续感染的重要前提条件。HPV-DNA整合检测有望成为判断病毒感染是否呈持续性、预测宫颈病变风险度、评估HPV治疗手段是否有效的重要辅助手段。HPV-DNA整合相关检测方法相对较多，但各有优缺点，找到最佳检测方法亦是目前亟需解决的问题。