肺癌干细胞的研究进展

李思佳 宋新宇 李文新

(三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 呼吸与危重症医学科 &三峡大学 呼吸系统疾病研究所，湖北 宜昌 443003)

据2018年全球肿瘤数据报道，肺癌已成为最常见的肿瘤之一(占总病例的11.6%)[1]，同时也是肿瘤死亡的主要原因(占肿瘤总死亡人数的18.4%)。肺癌是男性患者最常诊断的肿瘤，且在女性肿瘤患者中，肺癌的发病率也仅次于乳腺癌[1]。近30年来，由于靶向药物及放化疗的临床使用，肺癌患者5年生存率逐步提高，但随即产生的多药耐药(multidrug resistance，MDR)导致患者预后不良，目前肺癌的5年生存率仍低于30%[2]。因此，明确肺癌的发生、转移和耐药机制以及探索新治疗靶点仍是肺癌研究的重点和挑战。

肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)的发现为肺癌的治疗提供了新的靶点[3]。CSC是罕见的肿瘤细胞群体，具有自我更新以及在不同肿瘤环境中分化为多种细胞谱系的能力[4]。在染色体水平上，CSC中端粒酶的活性常增强。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，可反复添加DNA序列以延长端粒，并通过延长其端粒赋予细胞无限增殖的能力。另外，抗凋亡信号通路、膜转运蛋白活性以及迁移和转移的能力均会增加。因此，CSC可以介导肿瘤耐药性并维持肿瘤细胞长期存活，但通过干预CSC是否可缓解肿瘤多药耐药性并提高放化疗的疗效仍存在争议[5]。本文将对肺癌干细胞的起源、特点、肿瘤标志物、信号通路以及针对肺癌干细胞的靶向治疗进行论述，并对肺癌干细胞的应用前景进行分析。

1 肺癌干细胞起源

CSC又称肿瘤起始细胞(tumor-initiating cells，TICs)，是存在于肿瘤组织中的一类具有较强致瘤性、自我更新、无限增殖以及分化潜能的细胞，因其保持干细胞特性而又被称为肿瘤干细胞[6]。CSC由正常组织干细胞转化而来。正常组织干细胞具有自我更新能力，且生存周期较长，分为细胞静止期、增殖期和分化期。CSC是多种因素长期诱导、多步累积而产生的。正常情况下，大部分干细胞处于细胞静止期，发生突变的可能性较小，但当干细胞处于增殖期和分化期时将大大增加突变发生几率。即使大部分突变的干细胞会被机体识别并清除，但仍有少部分可能会被保留并继承下来。在全能干细胞分化过程中，每一阶段的干细胞都可能积累了不同程度的基因突变，而这些基因突变的干细胞可能因为微环境改变而发生细胞增殖和分化的失衡，最终转变为肿瘤干细胞[7]。肿瘤干细胞发生后可能参与一系列的肿瘤活动，例如引发肿瘤细胞更新、复发和转移、肿瘤滋养血管生成以及放化疗耐受性增加等[8]。因此，肺癌干细细胞(lung cancer stem cell，LCSC)可能是治疗肺癌、减少肿瘤的耐药性、转移及复发的重要靶点，靶向干预LCSC可能在源头上预防肿瘤的发生、耐药以及复发。

2 肺癌干细胞标志物

在临床诊疗过程中如何筛选LCSC一直是备受关注的话题。研究证明，肺癌干细胞可以表达多种干性标志物，如CD133、CD44、CD90、CD87、侧群细胞(side population cells，SP)、乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)等[9]。其中经典的糖蛋白CD133和CD44是筛选肿瘤干细胞最常用的表面标志物。

2.1 CD133

CD133是一种由prom基因编码的五次跨膜糖蛋白，分子量大约为120 kDa[10]。在造血干细胞、神经干细胞和内皮祖细胞等未分化细胞中常可检测到CD133的表达；并且研究发现CD133在癌组织中的表达较癌旁及正常组织显著增高，且与肿瘤细胞分化程度呈负相关[11]。另一研究证明，CD133可通过上调基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和缺氧诱导因子1α(hypoxia-induced factor-1α，HIF-1α)的表达水平促进LCSC的转移[12]。CD133广泛存在于多种CSC中，目前在肝癌、脑胶质瘤、结肠癌中均被证实为肿瘤干细胞标志物，其阳性表达率与肿瘤恶性程度密切相关[13]。然而，CD133不能单独作为鉴定肺癌干细胞的标志，还需同时联合其他的标志物进行分选，以提高其阳性率。

2.2 CD44

CD44是一种广泛分布的多功能跨膜表面糖蛋白，其作为信号受体可介导细胞黏附、增殖、分化、迁移、血管形成和蛋白酶对接等多种功能，另外它还能够接受细胞外基质糖基化以及作为透明质酸化信息的受体[14]。近年研究发现，肿瘤浸润转移与CD44有密切的关系，CD44可用于评价非小细胞肺癌患者的预后[15]。Leung等[16]研究发现，CD44+非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)细胞在裸鼠体内的分化能力增强。且与CD44-细胞相比，CD44+细胞对顺铂有更强的耐药性且具有更强的肿瘤干细胞成瘤能力。但目前CD44能否成为LCSC的特异性标志物还需进一步研究。

2.3 SP细胞表型

SP细胞是具有CSC特性的一类细胞，根据SP细胞表型分离纯化LCSC是目前的主要方法。其内膜广泛表达有ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC transporter)，主要包括ABCB1(P-糖蛋白，MDR1)，ABCC1-5(多药耐药蛋白，MRP1-5)和ABCG2(乳腺癌耐药蛋白，BRCP1)等[17]。Ho等[18]从H460、H23、HTB-58、A549、H441、H2170六种肺肿瘤细胞系中分离出的SP细胞中均高表达ABCG2，因此ABCG2被认为是SP的主要表型。研究证明，ABCG2在结肠癌、肝癌、肺癌等肿瘤中均可作为CSC标志物[19]。ABCG2作为膜转运蛋白，可利用ATP水解产生的能量将结构上与其不相关的小分子(例如细胞毒化疗药物)泵出细胞，导致细胞内药物浓度降低[20]。因此，肿瘤细胞的MDR现象可能与SP细胞的表达相关。

3 LCSC的相关信号通路

研究表明，正常组织干细胞的自我更新以及分化能力均受到一些信号传导通路的调控，它们失调或异常激活都会导致LCSC的形成和肿瘤的发生[21]。目前发现与LCSC关系密切的信号转导通路主要包括Wnt通路、Hedgehog通路和Notch通路等[4]。

3.1 Wnt信号通路

Wnt通路在哺乳动物胚胎发育和中枢神经系统的形成过程中发挥重要的作用，还可以调节细胞分化、增殖和运动以及参与多种组织的损伤再生过程。Wnt配体是一类分泌蛋白，与人类肺癌相关的Wnt配体主要有Wnt1、Wnt2、Wnt7a、Wnt5a。Wnt通路可分为β-连环蛋白依赖的经典Wnt通路以及β-连环蛋白非依赖的非经典Wnt通路[22]。在肿瘤细胞中β-连环蛋白的突变可以导致自身无法被磷酸化激活和泛素化降解，β-连环蛋白不仅可在胞浆内大量聚集，还可进入细胞核调控细胞分裂和生长调控相关的基因，导致细胞失控性增殖而致癌。Yang等[22]发现，在顺铂耐药的A549肺腺肿瘤细胞系中，Wnt5a可以通过其介导的非经典Wnt通路增加ALDH阳性LCSC的干细胞特性。

3.2 Hedgehog信号通路

Hedgehog信号通路在胚胎发育的早期发挥着极为重要的作用，同时它还与肺癌的发生发展息息相关。Hedgehog通路有三个同源基因：sonic hedgehog(Shh)、Indian hedgehog(Ihh)和desert hedgehog(Dhh)，分别表达Shh、Ihh和Dhh三种蛋白；还有跨膜受体Patched(PTCH)和Smoothened(SMO)，及其下游的转录因子为Gli (Gli1-3)[23]。Watkins等[24]发现，Shh和Gli-1在肺的气道上皮损伤修复中高度活跃，50%的SCLC患者肿瘤组织中有Shh和Gli-1表达，但在NSCLC中仅有10%的表达。Katoh等[23]还发现Hedgehog通路可与Wnt通路共同诱导CD133和CD44等干细胞标志物的表达，促进上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，从而促进肿瘤细胞浸润及远处转移，还可使肿瘤细胞获得干细胞特性和耐药性[25]。

3.3 Notch通路

Notch是广泛分布于多种细胞表面的短程通讯系统[26]。哺乳动物中已发现了四个相关受体(Notch1～4)，以及两个配体家族(Delta样和Jagged样)。它对于胚胎生长过程和正常成体干细胞中细胞的增殖和分化至关重要，已在SCLC和NSCLC中观察到Notch信号传导失调可促进CSC的产生和维持[27]。Westhoff等[28]发现，在NSCLC中，约1/3的样本存在着Notch通路的变异，并确定两种变异类型：Numb表达的缺失和Notch1功能获得性突变。Numb被认为是Notch信号通路的安全装置，Numb基因的缺失、突变都可激活Notch通路而导致肿瘤的发生。Notch通路和多种转录因子之间的交流可加强EMT的过程，使NSCLC获得更高的运动性、侵袭力及代谢活力。Sullivan等[17]发现，利用γ-促分泌酶抑制剂MRK-003阻断该信号可以导致肺癌ALDH+细胞显著减少，并伴有肿瘤细胞增殖能力降低，在体内外均抑制了肿瘤细胞的生长并增加肿瘤细胞的凋亡，这提示Notch通路可以作为LCSC靶向治疗的潜在靶点。

4 治疗

肺癌的传统治疗方式是手术治疗，辅之以顺铂、卡铂以及奈达铂等药物进行化疗。在化疗初期，患者的定位率以及5年生存率均明显增加。尤其是SCLC的患者，他们对化疗药物极其敏感。在晚期SCLC患者中，与非铂基药物相比，用铂基药物治疗的患者年生存率可提高5%[29]。但随之而来的是各种先天或后天的耐药，限制了化疗的治疗效果。对目前传统的肺癌治疗具有耐药性的患者来说，他们的有效治疗不仅要针对异质性的肿瘤细胞，更重要的是针对肺癌微环境中的CSC。因此，CSC标记不仅可能有助于识别和隔离这些肿瘤干细胞亚群，还可以提供特定的靶向治疗。

4.1 针对肺癌干细胞标志物的靶向治疗

CSC中存在多种小RNA(MicroRNA，miRNA)的异常表达，其中miR-34a可抑制肿瘤细胞，其类似物可能成为抗肿瘤药物[30]。靶向miRNA，其靶标可构成一种或者多种CSC标志物，能够降低肺癌中的药物耐药性，从而显著提高患者的治愈率和5年生存率[29]。研究发现，敲除CD133+细胞中oct-4的表达，可明显抑制肿瘤浸润，阻断CD133+细胞形成球体并促进这些细胞分化为CD133-，增加CD133+细胞的放化疗效果。另外，Xia等[31]发现抑制ABC转运体可以减少表达SP标志物细胞的耐药性。但ABC转运体在正常细胞中也有表达，这些正常干细胞的ABC转运体具有正常的生理作用。因此，针对性的抑制CSC中表达的ABC成员可能是更有效的途径。

4.2 针对信号通路的靶向治疗

研究发现Wnt-β-catenin途径在一些肿瘤的耐药性和肿瘤原性中发挥作用，抑制Wnt-β-catenin途径可能是一种靶向CSC的策略[32]。Sullivan[17]和Liu等[33]发现，利用γ-促分泌酶抑制剂MRK-003和DAPT(GSI-IX)阻断Notch信号通路，在体内外均可抑制肿瘤细胞的增殖，并促进肿瘤细胞凋亡，且GSI可显著增强顺铂的疗效。另外，Shh信号转导抑制剂对不同类型的肿瘤有治疗价值，但Shh抑制剂对肿瘤细胞具有细胞毒作用。

4.3 抑制EMT

EMT过程对肿瘤细胞的入侵和转移发挥重要作用，上述的一些信号通路会激活肺癌EMT过程，使肿瘤细胞获得干细胞特性和耐药性[34]。因此，抑制EMT过程也是治疗肺癌的一种策略。该过程与高表达肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)的肺癌不良预后有关，HGF是Met受体(EMT的有效诱导剂)的天然配体。当使用抑制剂PHA-665752和PF-2341066(克唑替尼)阻断Met磷酸化时，该表型可以逆转，从而为化疗耐受的SCLC提供新的治疗靶点[35]。克唑替尼是一种双重Met/ALK抑制剂，对携带微管蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合蛋白的患者有明显的益处[36]。此外，该化合物可以增强细胞对化疗药物的敏感性[36]。

5 结论与展望

由于肺癌的高发病率以及高死亡率，对于肺癌治疗的突破迫在眉睫。关于传统的肺癌治疗，如手术、放疗、化疗以及靶向治疗都是通过各种方式减少肿瘤细胞的数量，但是由于多药耐药的产生，其治愈率较低，且容易复发或者转移。肿瘤干细胞学说的提出为肺癌提供了更为有效的治疗策略，从耐药发生的根源解决问题。但是由于一些干细胞标志物不止存在于LCSC中，特异性低，所以很难识别治疗靶点。其次，LCSC和正常干细胞存在一些相似的功能及通路，在治疗时也难以区分。总之，LCSC理论上虽提供了新的思路，但由此带来的挑战也不容小觑，只有不断深入探究才能更新肺癌的治疗方法，提高肺癌患者的生存率。