用口蹄疫灭活苗稀释伪狂犬病、猪瘟活疫苗混合免疫效果评价

宋庆庆，佘志成，王 凯

（金宇保灵生物药品有限公司，内蒙古 呼和浩特 010030）

口蹄疫、猪瘟、伪狂犬病等病毒性疾病，在我国流行时间及区域广泛，是危害我国养猪业的重要病毒性传染病，猪场通常采用疫苗免疫预防这三种疾病，但由于猪场猪病复杂繁多，需要接种的疫苗种类也很多，往往在制订免疫程序时发生时间上的冲突。另外，研究表明非洲猪瘟病毒在相同感染剂量下，液体组和饲料组随着暴露次数增加，猪群感染几率也随之增加，当液体组的暴露次数达到10次时，最低感染剂量（1 TCID50）的感染几率接近100%。频繁接触猪只增加了非洲猪瘟的传播风险，每次免疫，一猪一针头，又会增加防疫人员的工作量。

为了更好地防控非洲猪瘟风险，解决减少免疫接种次数的同时又能达到同样的免疫效果的矛盾，试验结合实验室检测与临床试验，探索了用口蹄疫灭活疫苗稀释伪狂犬病活疫苗和猪瘟活疫苗的组合免疫方案。实验室通过测定TCID50评估猪瘟和伪狂犬病疫苗毒效价的衰减情况，另外在此基础上选择一普通规模化养猪场的商品猪群，将口蹄疫、猪瘟、伪狂犬病疫苗按照不同组合进行了免疫接种试验，通过抗体检测以验证疫苗免疫效果。

1 材料与方法

1.1 试验猪场

江苏省南通市某规模化猪场，经产母猪 300头，自繁自养，封闭式管理，猪群总体健康状况良好。正常免疫猪瘟、口蹄疫、伪狂犬病等疫苗，各项生产成绩和技术指标正常。供试猪为该场母猪所产的健康仔猪，每头试验仔猪打耳标，做好标记。

1.2 疫苗

猪口蹄疫OA二价灭活疫苗（Re-O/MAY98/JSCZ/2013株 +Re-A/WH/09株），批号为18392270，由金宇保灵生物药品有限公司生产；猪伪狂犬病耐热保护剂活疫苗（C株），批号为19225026，由扬州优邦生物药品有限公司生产；猪瘟活疫苗（传代细胞源），由辽宁益康生物股份有限公司生产，批号为19335032。

1.3 检测试剂及仪器

FMD-Ab 检测试剂盒、PRVgEAb 检测试剂盒均为内蒙古金迈诗生物科技有限公司诊断试剂盒；PRVgB-Ab 检测试剂盒为荷兰百测（BioChek）诊断试剂盒，操作方法及结果判定标准均按照各试剂盒说明书进行。猪瘟野毒与兔化弱毒疫苗株实时荧光RT-PCR检测试剂盒，伪狂犬病野毒与gE基因缺失株实时荧光PCR检测试剂盒，伪狂犬病病毒（gB基因）实时荧光PCR检测试剂盒购自国测生物，操作方法及结果判定标准均按照各试剂盒说明书进行。

1.4 疫苗混合液准备

分别取 1 瓶50头份猪口蹄疫OA二价灭活疫苗、 5 瓶10头份猪伪狂犬活疫苗，5瓶10头份猪瘟疫苗，室温回温2小时处理后，以口蹄疫疫苗为稀释液，稀释伪狂犬病和猪瘟疫苗，将稀释好的组合疫苗混合液注回到口蹄疫疫苗瓶中，上下颠倒几次充分混匀后观察是否发生分层、不溶等肉眼可见性状变化。

1.5 疫苗混合液黏度检测

分别检测混合前口蹄疫疫苗单品及口蹄疫疫苗稀释伪狂犬病和猪瘟活疫苗之后混合液的黏度变化。

1.6 q-PCR检测

口蹄疫疫苗稀释猪伪狂犬病和猪瘟活疫苗制成混合液后，用连续注射器将疫苗分50次，2 mL/次，注射到离心管中，模拟疫苗注射到猪只体内效果，用q-PCR的方法分别检测每一离心管中猪瘟和猪伪狂犬病疫苗核酸的相对含量（Cq值）。

1.7 测定猪伪狂犬病疫苗病毒效价（TCID50）

试验组为口蹄疫疫苗稀释猪伪狂犬病冻干活疫苗，破乳分层后取水相备用，对照组用MEM无血清培养基稀释猪伪狂犬病冻干活疫苗备用。ST 细胞培养至单层后，弃去细胞液；将准备好的疫苗毒样品用DMEM无血清培养基按照10倍稀释度连续倍比稀释到10-9，将不同稀释度的毒液加入96孔细胞培养板中，每个浓度做8个重复孔，每孔100 uL，吸附 1 h后，加入维持液；培养 96 h 后，观察 CPE，记录每个稀释度的 CPE 数量，按照 Reed - muench 方法计算 TCID50。

1.8 测定猪瘟疫苗病毒效价

试验组为口蹄疫疫苗稀释猪瘟冻干活疫苗，破乳分层后取水相备用，对照组用MEM无血清培养基稀释猪瘟冻干活疫苗备用。用实验室自行建立的IFA方法检测两组稀释后的猪瘟疫苗抗原含量。

1.9 临床疫苗免疫试验分组

选择日龄相近的保育猪进行试验，试验分试验组与对照组进行，两组仔猪出生时均用猪伪狂犬病疫苗滴鼻1头份，4周龄免疫猪瘟疫苗1头份。试验组7周龄用口蹄疫疫苗作为稀释液，稀释猪伪狂犬病和猪瘟活疫苗，混合液肌肉注射2 mL/头（含口蹄疫疫苗1头份、猪瘟疫苗1头份、猪伪狂犬病疫苗1头份），12周龄用口蹄疫疫苗作为稀释液，稀释猪伪狂犬病活疫苗，混合液肌肉注射2 mL/头（含口蹄疫疫苗1头份、猪伪狂犬病疫苗1头份）。对照组7周龄，猪伪狂犬病和猪瘟活疫苗，分别用专用稀释液稀释再与口蹄疫灭活苗，颈部肌肉分边注射，12周龄猪伪狂犬病活疫苗，用专用稀释液稀释与口蹄疫灭活苗，颈部肌肉分边注射，口蹄疫疫苗2 mL/头，猪伪狂犬病活疫苗1头份，猪瘟活疫苗1头份。试验组免疫100头仔猪，对照组免疫90头仔猪。

1.10 采血及抗体检测

两组分别在4周龄、7周龄、12周龄、17周龄采血，每组10头，分离血清，检测FMD-Ab、PRVgEAb和PRVgB-Ab、CSF-Ab抗体水平。

2 结果与分析

2.1 疫苗混合液性状观察

口蹄疫疫苗稀释猪伪狂犬病和猪瘟冻干疫苗能很好地溶解，瓶底没有沉淀和不溶成分，疫苗混合液样品混合摇匀后未发生分层、沉淀等肉眼可见性状变化。

2.2 黏度检测结果

对比口蹄疫灭活苗单苗组与组合稀释组按照离心处理，剂型无变化，黏度变化很小(见表2)，对通针性没有影响。

2.3 qPCR检测猪瘟和伪狂犬病核酸相对含量

对随机选取的28份离心管中的样品，提取核酸检测猪瘟疫苗毒核酸Cq值，每份样品做一个重复，检测结果如表3，其中“Cq平均值”的算术平均值为26.46，CV%值为2.12，有很好的均匀度。

对随机选取的28份离心管中的样品，提取核酸检测伪狂犬疫苗毒核酸Cq值，每份样品做一个重复，检测结果如表4，其中“Cq平均值”的算术平均值为19.27，CV%值为6.14，有很好的均匀度。

表1 各组免疫程序设计

表2 各组黏度检测

2.4 猪伪狂犬病疫苗病毒效价

对比发现用口蹄疫疫苗稀释与用MEM溶液稀释相比，猪伪狂犬病活疫苗TCID50没有差异（见表5）。

2.5 猪瘟疫苗病毒效价

对比发现用口蹄疫疫苗稀释与用MEM溶液稀释相比，猪瘟活疫苗TCID50没有明显差异（见表6）。

2.6 临床疫苗免疫试验各试验组抗体检测结果

两 组 免 疫 后 4 h、8 h、24 h，猪只均未出现呕吐、精神沉郁、不食等副反应。液相阻断ELISA检测结果表明无论是组合免疫组还是对照免疫组在二次免疫后五周检测，口蹄疫O型抗体和A型抗体100%均达到＞1：128，符合农业部＞1：64比例在70%以上的要求（见表7）。同时此次试验也表明此口蹄疫灭活疫苗稀释猪伪狂犬病活疫苗不影响口蹄疫疫苗的免疫效果。

根据ELISA检测结果，免疫前后gE抗体均为阴性，表明该场本批次商品猪未受到伪狂犬病毒的感染，gB抗体为免疫猪伪狂犬病活疫苗产生，试验组（组合免疫组）两次免疫后，gB抗体不低于对照组分开免疫的效果。对照组首免时母源抗体偏高可能对疫苗会有干扰（见表8）。

根据ELISA检测结果，猪瘟免疫前母源抗体偏高，造成了首免后抗体的下降，但是二免后抗体迅速上升，12周龄后两组均达到100%合格率，试验组（组合免疫组）两次免疫后，猪瘟抗体与对照组（分开免疫组）无显著差异（见表9）。

3 讨论

口蹄疫为我国一类传染病，原农业部制定《国家口蹄疫防治计划（2012-2020）》，提出坚持预防为主，分型控制，大力推进免疫预防，疫情监测等措施[1]。《国家猪瘟防治指导意见（2017—2020 年）》，要求各地继续对生猪实施猪瘟全面免疫，进一步落实各项综合防控措施，有效控制、逐步消灭猪瘟[2-3]。伪狂犬病是危害全球养猪业的一种重要传染病，曾被认为是危害仅次于口蹄疫和猪瘟的主要传染病之一[4]，2011年起，我国多地区猪场发生变异株伪狂犬病毒的流行[5-6]，2018年对全国358个规模猪场调查发现规模猪场伪狂犬病阳性率达72.63%[7]，高质量疫苗免疫对该病的控制效果确实，尤其是猪伪狂犬病耐热保护剂活疫苗（C株），有望成为净化该病的重要措施[8-9]。自2018年非洲猪瘟传入我国以来，对国内养猪业造成重创，所有生存下来的养猪企业，无一不投入巨大精力和资金用于提高各项生物安全措施，然而在减少一切与猪只不必要的接触的意识支配下，一些必要的免疫操作也被省去，从而造成之前得到较好控制的部分传染病有抬头趋势。

表3 混合疫苗猪瘟核酸相对含量检测

表4 混合疫苗伪狂犬病核酸含量检测

表5 各组伪狂犬病抗原效价

表6 各组猪瘟抗原效价

表7 各组免疫前后口蹄疫抗体变化 %

表8 各组免疫前后伪狂犬病抗体变化 %

表9 各组免疫前后猪瘟抗体变化

口蹄疫、猪瘟、猪伪狂犬病三种疫苗的混合操作，能很大限度地减少疫苗免疫次数，降低劳动强度，减少猪只的刺激，减少可能的因注射和接触带来的疫情传播风险。猪口蹄疫OA二价灭活疫苗（Re-O/MAY98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株）采用进口206佐剂，为水包油包水剂型， pH控制在7.4~7.6，成品疫苗不含灭活剂BEI，实验室检测与MEM相比溶解猪伪狂犬病和猪瘟冻干活疫苗，其抗原含量衰减情况无差异。

根据大数据检测，免疫口蹄疫和猪伪狂犬病高效疫苗的猪群口蹄疫和伪狂犬病母源抗体衰减情况类似[9-10]，首免时间均可以放在8~12周龄，正好与猪瘟二免在同一时间。规模猪场可以考虑先在4~5周单免猪瘟，8~9周进行口蹄疫、伪狂犬病和猪瘟的混合免疫，12~13周进行口蹄疫和伪狂犬病的混合免疫。由于母源抗体的差异，不同猪场为了获得最佳的免疫效果，需要在使用前进行抗体检测，掌握适合本场的免疫程序，同时混合免疫时应注意疫苗混合过程中无菌操作。目前临床统计了部分用户的使用数据，截止目前江苏、浙江、湖南、广西、湖北、四川、云南、辽宁、陕西等省组合免疫共43 206头，产生应激48头，比例0.11%，临床混合易操作，免疫效果良好，不良反应少。