非洲猪瘟病毒的遗传和抗原多样性

崔茂盛（编译）

（天津市畜牧兽医研究所，天津 300381）

1 引言

非洲猪瘟病毒（ASFV）是病毒家族中唯一非常独特的成员（Alonso et al.， 2018）。在家猪和野猪（Susscrofa）中，ASFV是高致病性的，能够引起出血性及高致命性的ASF疾病，而且ASFV可在不同物种之间流行和暴发。近年来，ASF迅速蔓延，对全世界生猪产业造成巨大威胁（Cisek et al., 2016;Jurado et al., 2018; Kyyroet al., 2017;Nurmoja et al., 2017; Sanchez-Cordon et al., 2018; Vergneet al.,2017），可惜目前仍无安全有效的ASF疫苗可用。ASFV的毒力、免疫原性，更重要的是病毒表型和抗原多样性等一直困扰着ASF疫苗研发进程（Arias et al., 2017; Revilla et al., 2018; Rock, 2017）。 认 识ASFV具有多样性的关键是ASFV基因和基因组变异。ASFV的衣壳蛋白（p72）基因（B646L）是最早用于大规模评估ASFV遗传多样性的遗传靶点之一（Bastos et al., 2003）。在B646L基因部分测序的基础上，Bastos和同事鉴定了22个ASF基因型，建立了标准的ASFV基因型标记，但p72基因分型有时并不能够提供足够的分型分辨率来区分不同生物表型的病毒（Malogolovkin et al., 2015a）。 通 过对p54 （E183L）、p30 （CP205L）和B602L基因的研究，进一步提高了ASFV基因型分辨率（Bastos et al.,2004; Lubisi et al., 2007,2005; Gallar do et al., 2009; Nix et al., 2006）。目前，全基因组测序技术可为ASFV生物学多样性研究提供有力手段。文章主要综述ASFV遗传和抗原多样性的研究成果，并提出阐明ASFV多样性的关键科学问题。

2 ASF基因和基因组

目前已测序的ASFV基因组长度不一，大小从170 101到193 886个碱基对。ASFV许多基因都是基于与痘病毒的同源性而命名（Dixon et al., 2013;Galindo and Alonso, 2017），并对与ASFV参考毒株ba71v及其他毒株的亲缘关系进行了深入的研究（Chapman et al., 2008; Rodríguez et al., 2015; Yáñez et al., 1995）， 但到目前为止ASFV许多核心基因的功能仍然未知。该核心基因区域存在着可变基因和基因间区域（例如中心可变区，或CVR等）。比较基因组分析还确定了一系列分布在基因组核心区域内外的基因，作为ASFV基因组中最可变的同源基因即CD2v/EP402R和c型凝集素/EP153R，可能是ASFV遗传多样性的来源（Chapman et al., 2011; de Villiers et al.,2010），与核心区域相比，位于末端的ASFV线性基因组区域在大小和基因含量上更具有差异性，被称为左变区和右变区（LVR和RVR）。ASFV末端基因组区域主要由同源基因的多基因家族（MGF）控制。5个MGFs （MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505）根据其平均氨基酸长度命名 （Almendral et al., 1990; Chapm an et al., 2008; Dixon et al., 2013; Gon zález et al., 1990; Pireset al., 1997; Yoz awa et al., 1994）。在功能基因组研究中，已经证明了MGF360的毒力和功能，并指出MGF505可能是病毒毒力因子之一，为疫苗的设计研发提供了新的思路（O’Donnell et al.,2016, 2015; Reis et al., 2016）。

自东欧首次发现ASFV以来，登记的ASFV序列数量迅速增加。来自爱沙尼亚、波兰、拉脱维亚、立陶宛的ASFV基因序列显示，ASFV基因组高度稳定，和亲代ASFV/亚美尼亚2007毒株之间超过99%的同源性（FR682468）。然而，目前已在不同基因和基因间区域发现了多个单核苷酸的变化，包括翻译蛋白的移码和终止区（Fracz yk et al., 2016; Gallardo et al., 2018a,2018b; mietankaet al., 2016）， 这 些微小变化的生物学意义需要被充分研究。有趣的是，虽然大多数毒株的ASFV基因组GC含量平均约为38%，但GC含量相对较低的区域位于LVR和RVR以及中心区域（图1）。GC含量的减少可能在病毒进化中发挥重要作用，也可能是GC碱基合成的生化成本较高的结果 （Šmarda et al., 2014）。

尽管对ASFV研究的历史悠久，但可公开获得的ASFV全基因组序列数量有限。GenBank包含42个完整的ASFV基因组序列，其中只有33个属于野毒毒株。为了更好地掌握该病毒基因组的可塑性、抗原多样性和进化特征，需要更多更完整的ASFV序列。在污水（Lohet al., 2009）和海洋环境（Ogata et al., 2009）中也发现了类似于ASFV序列，提示人们若利用宏基因组技术，可能会发现更多类似 ASFV 序 列（Kuhn et al., 2019）。一般来说，DNA病毒的突变率比RNA病毒低（Sanjuan et al., 2010）。利用贝叶斯统计评估ASFV基因区 域（B646L, CP204 L和B602 L/CVR）基因的进化率，B646L位点每年的进化率可能为RNA病毒的6.9×10-4。对来自东非的ASFV分离株研究表明，B602L基因小规模串联重复序列（TRSs）数量有所增加（Lubisi et al., 2007, 2005），同样在欧亚流行的ASFV毒株中，如高加索、俄罗斯和欧洲ASFV分离株的研究中也发现了TRSs （Gallardo et al., 2014; Golleret al., 2015; Kolbaso v et al., 2018）。从2014年到2018年，欧洲和中国的ASFV分离株中发现了越来越多的突变（Bao et al., 2019;Cisek et al., 2016; Gallardo et al.,2018a,2018b; Garigliany et al., 2019; Ge et al.,2018; Smietanka et al.,2016; Zhou et al., 2018）。但这些小规模的核苷酸突变与ASFV表型之间的生物学意义和相关性仍不清楚。

与单核苷酸突变相比，基因含量的变化更容易解释病毒表型的变化（Zaniet al.，2018）。 同 源 基 因的ASFV多基因家族（MGF）是最易变的遗传组成部分，相对于基因组的其他部分，其基因含量发生了巨大的变化，且出现了基因复制、序列分化、基因缺失和重组等现象，这些都会对ASFV基因组的结构产生很大的影响（De La Vega et al.,1990; Yáñez et al., 1995）。 携带多个MGF拷贝的ASFV毒株具有更大的基因组（图1），并通常与更强的毒性相关（Chapman et al.,2008; Krug et al., 2015; Rodríguez et al.,2015）。重组虽然是基因进化的主要驱动力（Barton, 2010），但其是否发生在ASFV毒株之间尚未有明确的证据。系统发育重构的研究表明，ASFV重组事件经常发生在MGF、E183L、B602L、EP153R 和EP402R（CD2v）等基因部位（Chap man et al., 2008; Michaud et al., 2013;N efedeva M. et al., unpublished）。总之，这些产生多样性的进化过程驱动特定基因和编码抗原的变化，这些研究结果可能会影响到疫苗接种策略或弱毒活疫苗的稳定性。

3 血清型的抗原多样性

Malmquist在1960年首先利用红细胞吸附试验（HA）和红细胞吸附抑制试验（HAI）评估不同ASFV分离株在体外血清学交叉反应，鉴定出几种ASFV抗原类型（Malmquist and Hay, 1960）。此 后，探讨病毒抗原类型的决定成分成为研究的热点。作为区分血清型特异性的有力工具，目前HAI已在俄罗斯联邦病毒学和微生物学研究中心被广泛使用，并建立了基于HAI的ASFV分类，以区分病毒抗原类型，确定了8个ASFV血清组并进行了详细的鉴定。后来参考其他参数如血凝素密度（每个受感染细胞的红细胞数），进一步改进了ASFV的 分 类（Makarov et al., 2016）。基于HAI分析的ASFV毒株筛选可用于开发一种潜在的弱毒活疫 苗（Sereda et al., 1992; Sereda and Balyshev, 2011）。 其 实，Malmquist W.A早已发现HAI分类的意义，他使用HAI分析开展了同源或异源性的ASFV分类。根据他的研究结果，感染后恢复期猪的血清可以抑制感染了同源ASFV的巨噬细胞中的HA。血凝吸附抑制的关键如图2所示。幸运的是，Rodriguez等 人 在1993年 发现了负责介导HA的病毒决定成分为ASFV编码的细胞CD2同源物，即CD2v蛋白的EP402R基因（Rodríguez et al., 1993）。 后 来，ASFV c型凝集素样蛋白（EP153R基因）被认为是HA的辅助抗原（Galindo et al.,2000）。比较基因组研究已经确定这些基因是ASFV分离毒株中最具多样性的基因（Cha pman et al., 2008; deVilliers et al.,2010），超过80株ASFV毒株系统发育分析显示，CD2v/ c型凝集素基因型组与HAI血清学组相关，并显示出CD2v/ c - electin与保护性免疫反应之间具有很强的相关性，该研究进一步提出了尚未在血清学上确定特征的其他潜在血清组（Malogolovkin et al., 2015b）。 由 于ASFV CD2v/ c型凝集素蛋白在体内具有特异性免疫保护和体外细胞免疫的特性，目前已与HAI 血清特异性关联在一起，称为血清型特异性ASFV抗原（Burmakina et al., 2019,2016; Malogolovkin et al.,2015b）。然而，CD2v和c型凝集素虽然在体内对介导交叉保护反应很重要，但在血清型特异性同源保护方面还不够理想，暗示仍需鉴定更多的血清型特异性保护抗原。利用ASFV蛋白p30、p54和CD2v开展的亚单位疫苗目前也只具有部分诱导免疫保护作用，而且它们在促进血清型特异性应答方面的作用机制尚不清楚（Argilaguet et al., 2013; Barderas et al., 2001; Gómez-Puertas et al., 1998;Ruiz-Gonzalvo et al., 1996）。 利 用康复动物抗体介导的HAI仍是目前研究ASFV疫苗抗原多样性和保护潜力的重要手段。ASF康复猪血清的抑制潜力取决于血清活性、病毒剂量和同源或异源病毒类型等等（Rodríguez et al., 1994; Ruiz Gonzalvoet al., 1986a, 1986b）。但是，HAI分类和感染抑制试验的结果与“经典”病毒中和试验的结果无关，这是一种影响体内保护的新机制。

ASFV抗原多样性是阻碍ASFV疫苗开发的关键因素。最近研究表明，ASFV弱毒活疫苗（缺乏CD2v的ASFV 毒株BA71） 对ASFV Georgia/2007具有对异源病毒交叉保护的潜力（Monteagudo et al., 2017）。 当 前蛋白质组学研究也已证实ASFV蛋白质组同样具有复杂性和灵活 性（Alejo et al., 2018）， 并发现了一些新的ASFV蛋白质（Kessler et al.,2018）。ASFV蛋白质组受到病毒和细胞本身严格的动态调控，所以可能会因病毒株和宿主细胞的差异而发生重大变化。由此可见，ASFV基因组和/或抗原多样性可以影响宿主反应的多样性，研究ASFV-宿主相互作用，有望将病毒基因型差异与表型多样性进一步相关联。

抗ASFV免疫是一种类型的特异性免疫，可能与血清特异性抗体的水平相关。当免疫动物被异源性ASFV株感染后往往使ASF病情加重或导致更严重的其他疾病，因为先前体内存在的免疫可能通过抗体依赖性增强（ADE）机制诱发更严重的发病（Khandia et al., 2018; Li et al., 2018）。虽然先前存在的ASFV免疫可能会影响T-细胞和抗体的反应，但ADE主要是由中和能力较低的交叉反应抗体引起的。尽管目前尚不清楚ADE机制是否发生在ASFV发病过程中，但在疫苗如何解决ASFV抗原多样性问题方面，ADE机制仍可能具有重要意义。

4 结论

自1921年首次报告非洲猪瘟以来已近一个世纪，作为病毒家族中的一种独特病毒，ASFV对世界生猪养殖的威胁比以往任何时候都大。ASFV的多样性和复杂性是阻碍疫苗开发的关键因素。开展对历史上的和不同的ASFV毒株基因测序分析，将有助于了解来自不同宿主的ASFV基因组之间的多样性，有助于揭示ASFV进化关系，有助于确定抗原和表型变异的决定基因。基于ASFV CD2v的红细胞吸附和比较基因组学，为识别与病毒抗原表型和交叉保护免疫相关的遗传特征提供了一种可靠的方法。而识别其他血清型特异性保护性抗原，可能是设计特异性和有效性ASF疫苗所必需的。