猪精液冷冻关键技术的研究与应用探析

王怀禹

（南充职业技术学院，四川 南充 637131）

人们受牛精液冷冻技术的启发，从20世纪60年代开始了猪精液冷冻的制作研究，近年来，其受到全球养猪业的高度重视和广泛关注，世界范围的研究者为其开展了大量的工作，取得了一定的成效。我国从20世纪50年代初期就开始了对猪精液冷冻技术的探究，但由于缺乏持续性，研究进展不大，但近几年，像温氏集团、百钧达科技发展（北京）有限公司及中国农业大学等单位都在积极进行猪冷冻精液的研究，取得了不错的效果。总体来看，猪精液冷冻技术的研究虽然走过了近70年的探索历程，对其工艺流程也进行了不断优化，鉴于猪精子有区别于牛羊精子的生理特性，精子在冷冻和解冻过程中更易受到损伤，致使母猪繁殖成绩不理想，导致目前冻精的使用仍没有得到大范围推广。但这并不妨碍人们探索猪精液冷冻技术的步伐，猪精液冷冻所带来的诸多益处及广阔的应用和发展前景也非常值得研究者继续为之做出努力，猪精液冷冻工艺流程中任何一个环节所能取得的进展，都可为今后猪冷冻精液标准化、规模化生产提供依据。

1 猪精液冷冻技术操作流程

猪精液冷冻制作的剂型主要有颗粒冻精、0.25/0.5/5 mL规格细管冻精以及5 mL扁平塑料袋冻精几种。目前，国内猪精液冷冻工艺流程基本相同（如图1）。

2 猪精液冷冻关键技术环节研究及应用

2.1 精液采集与品质鉴定

优质的精液是制作冷冻精液的基础和前提，因此，除需要保证公猪良好的饲养管理条件外，对公猪精液的采集是尤为重要的。个别规模化猪场采用了自动采精系统，但仍有相当部分猪场采用的是传统的手握法采精，这就要求工作人员必须按照规范的程序实施采精。主要注意不要污染精液，精液中的胶状物质要弃去，只收集猪射精中间部分的精液。精液品质鉴定遵循先外观后微观的操作步骤，即先观察精液的颜色、气味、采精量几个方面是否正常，然后再在显微镜下观察精子的活率、密度、畸形率及顶体异常率是否在正常范围内（如表1）。

2.2 稀释液成分的优化

精液稀释液既可以扩大精液的容量，又可以保护稀释后的精子，因此，优质的精液稀释液是提高冻精质量的重要一环。猪精液冻精稀释液的主要成分见表2。猪冷冻精液稀释液成分的优化一直是精液冷冻研究的热点，主要集中在营养剂、抗冻剂和抗氧化剂的研究上。

2.2.1 营养剂

由于精子只能进行分解代谢，需要在其稀释液中添加一些六碳糖作为营养剂，如葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、海藻糖等，以补充精子能量耗损。可见在猪精液稀释液中补充糖类非常重要，研究发现，以果糖效果最好。但在实际生产中，考虑到果糖价格较贵，多用蔗糖或葡萄糖作替代。研究表明，在猪冻精稀释液中加入低浓度的六碳糖能取得较好的保存效果，过高浓度反而对精子顶体有害。Yi 等[1]研究发现，如果加入可溶解性氮-乙酰-D-氨基葡萄糖（0.05%）于猪冻精稀释液中，解冻后的精子顶体完整率和活率有显著提高。Paulenz 等[2]研究发现，稀释液中添加果糖和蔗糖的效果反而不及乳糖好。李青旺等[3]研究表明，在猪冻精稀释液中添加复合多糖（乳糖+2%～3%的葡萄糖）的效果较好。潘红梅等[4]也研究了不同浓度的双糖混合液对猪冻精保存效果的影响，发现乳糖（33.3%）+蔗糖（66.7%）组合对猪冻精保存的效果是最好的。

2.2.2 抗冻剂

精液在快速冷冻过程中，为避免或减轻冰晶造成的机械性物理性损伤，需要在稀释液中添加甘油、二甲基亚砜（DMSO）及三羟甲基氨基甲烷（Tris）等抗冻物质。刘晋津等[5]研究发现，4% 甘油浓度冷冻后精子活率为0.483±0.698，达到最佳状态。二甲基亚砜就是一种毒性极低的抗冻剂，可以克服甘油浓度较高时对精子的渗透毒性影响。马丽等[6]研究表明，用二甲基亚砜完全替代甘油的冻精解冻后，添加6%二甲基亚砜试验组的精液品质质量有明显提升，分别达到：精子活率26%、精子畸形率16%、质膜完整率49%及顶体完整率51%，均明显优于其他二甲基亚砜添加组（P<0.05）和对照组，也优于30 mL/L甘油组，且最佳添加剂量为60 mL/L；同时，750 mL/L甘油与250 mL/L二甲基亚砜混合冻精解冻后的活率优于只添加二甲基亚砜组的效果，且畸形率、顶体完整率、质膜完整率优于30 mL/L甘油对照组。除了单一研究某种抗冻物质对猪精液冷冻保存的作用效果外，2种及多种混合抗冻物质对精液冷冻保存效果的探索也一直没有中断过。研究发现，谷氨酰胺等氨基酸可发挥类似甘油保护剂的功能，但又不可能彻底取代甘油，需要通过与卵黄、甘油等结合使用才能产生保护作用[7]。张树山等[8]研究发现，在鸡卵黄低密度脂蛋白（9%）冷冻稀释液中添加40 mmol/L的谷氨酰胺对冷冻猪精子直线向前运动速度、精子活率、顶体完整率和质膜的完整性均达到最佳，优于对照组（P<0.05）。

表1 公猪精液品质评价项目参考值

表2 猪精液冻精稀释液主要成分

2.2.3 抗氧化剂

猪精液冷冻过程中会产生大量的活性氧（ROS），有赖于添加外源性的抗氧化剂进行消除，以维持精子细胞完整的结构不被破坏。有研究表明，在猪精液冷冻稀释液中添加一定浓度的维生素C或维生素E能够提高精子活率，保持解冻后精子顶体结构的完整性[9,10]。黄俻华等[11]研究发现，猪精液冷冻稀释液中如果加入维生素C或维生素E的浓度较高时，精子顶体、质膜的完整性、线粒体的活性以及解冻后精子的存活时间将会得到显著提高。事实表明，600 μg/mL 的维生素C或维生素E，是显著提高陆川猪精液冷冻保存效果的最佳添加剂量，解冻后精子的活力和畸形率都显著优于对照组（P<0.05）。Gadea等[12]研究发现，在猪精液冷冻稀释液中添加适量还原GSH可以增强精子核蛋白结构的稳定性，保持其受精能力，解冻后精子质量获得整体性的提高。张斌等[13]研究发现，猪精液冷冻稀释液中添加5 mmol / L 的GSH和900 μg/ mL的HA能明显增强猪精液冷冻效果。Varo-Ghiuru等[14]研究发现，猪冻精稀释液中保持适当浓度的叶黄素有助于维持精子结构的完整，增强解冻后精子对渗透压的耐受性，提高精子活率。王捷等[15]研究结果表明，天然抗氧化剂芝麻酚（3，4－亚甲二氧基苯酚，sesamol，SM）非常利于猪精子的冷冻保存，0.2 g/L芝麻酚为保持精子结构完整性的最佳添加剂量，其解冻后猪精子活率和抗氧化能力得到显著提高（P<0.05）。孙艳青等[16]研究发现，新型高效抗氧化剂—葡萄籽原花青素（葡萄籽提取物）对冷冻—解冻后的猪精子抗氧化具有保护作用，其抗氧化能力大大超过维生素C和维生素E。结果显示，40 μg/mL的葡萄籽原花青素是最佳添加剂量，精液冷冻保存效果均优于其他对照组。有的学者研究发现，红景天多糖、淫羊藿多糖等均具有较强的免疫活性和抗氧化活性，红景天多糖的最佳添加剂量为6 mg/mL，淫羊藿多糖的最佳添加量为4 mg/mL，可显著提高解冻后精子的活率、质膜及顶体完整率[17，18]。

2.3 猪精液冷冻各环节温度的调控

猪精子对温度最为敏感，而猪精液冷冻过程中几乎每一个环节都涉及到温度（如表3），只有严格按照各环节所要求的温度条件下实施操作，才不会使精子发生冷休克以及形态和结构上的改变，确保冻精质量的稳定可靠。

2.4 精液冷冻生产过程中的质量控制

猪精液冷冻技术受到猪品种、稀释液的组成、渗透压、糖、冷冻保护剂、添加物冻前处理、冷冻保存承载工具、冷冻解冻程序等众多因素的影响。大量研究表明，猪精液冷冻解冻后效果不尽一致，也验证了猪冷冻精液质量容易出现波动，质量不稳定。精液冷冻过程中任何一个关键技术环节上的不规范或操作失误均可导致冻精质量下降或制作失败。以冷冻保存承载工具及冷冻过程对精液冷冻保存效果的影响为例，薛琦[19]研究发现，即使都是细管冻精，但它们解冻后精子的活率存在差异，0.5 mL细管冻精好于0.25 mL细管冻精；距离液氮面的距离也会影响冻精解冻后精子的活率，距离液氮面较近的冻精，解冻后的活率优于距离液氮距离较远的。因此，为确保猪精液冻后质量始终处于稳定与可控状态，对生产工艺流程的每一个环节与每一个步骤，均应严格按照规范化、标准化作业程序执行，不定期对精液质量性状进行评估和追溯分析，对存在的问题及时进行改进与优化，为猪冷冻精液技术规范标准提供经验积累，也为今后实施养猪标准化生产奠定坚实基础。

3 问题与展望

虽然猪精液冷冻技术的研究与应用取得了一定成效，但从全球范围看，猪冷冻精液配种还不到0.5%，说明猪精液冷冻保存技术仍有很多问题需要解决。如缺乏冷冻保存各工艺流程制作标准和规范以及缺乏一套完整的、科学的冷冻与保存体系等。尽管如此，由于中国乃至全球养猪业所占的市场份额决定了人们会不断探索和改进猪精液冷冻技术存在的诸多关键性技术难题，对猪冷冻精液技术的研究和推广只会更加深入。百钧达公司在猪精液冷冻技术方面已经取得突破，能够使解冻的冻精达到76%～85%的活率，让我们看到了胜利的曙光。可以预言，猪冷冻精液取代鲜精配种是大势所趋，猪冻精的商业化应用指日可待。

表3 猪精液冷冻工艺流程温度要求