浅谈猪精液保存在人工授精中的发展与展望

王利娟，常 枨

（北京农学院 动物科学技术学院，北京 102206）

人工授精是世界范围内应用最广泛、最有效的生猪繁殖技术。猪人工授精技术在我国养猪业已经取得了很高的效率，对猪品种改良和选育做出了巨大贡献。尽管猪冷冻精液技术取得了重大进展，但液体保存仍然是广大猪场猪精子保存的主要方法。而在激烈的市场竞争中，人们希望通过提高精液保存的质量来进一步提高育种效率。文章简要回顾了过去和现在世界范围内猪液态精液和冷冻精液保存、应用的情况，并对非洲猪瘟下改进猪精液保存技术助力生猪生产提出了建议。

1 发展情况

在全球的动物生产繁殖领域中，人工授精技术应用十分广泛，取得了极为可观的成绩。该技术的应用，使得优质种公畜的配种率和利用率均得到了大幅提高，加速了优质家畜的改良进程，并且还克服了公母畜因为身体素质、偏好、生殖器官异常等造成的配种困难，提高了生产繁育的安全性，减少了疾病的传播；而且可以减少饲养种公畜所需要的场地、饲料、和劳动力等饲养成本。人工授精技术最先应用到牛的生产繁殖中，而真正应用到猪的生产中比牛要晚得多。在20世纪初期，来自俄罗斯的科研人员就尝试进行对猪的人工输精，这是有报道以来世界上第一次将该技术运用到猪身上。猪人工授精技术在1932年首次试验成功，后来该技术在许多国家中运用；随着技术的进步，日本和英国等几个国家率先实现了将猪人工授精达到了实用水平。我国的猪人工授精技术推广应用在20世纪50年代开始试行，随着我国生猪养殖规模的扩大，该技术在20世纪70年代末开始得到了突飞猛进的发展，而后在全国得到了普及推广，进一步提高了我国生猪生产的存栏量与良种质量。而在国际方面，自从20世纪80年代人工授精获得技术革新后，人工授精技术在极短的时间内迅速普及到欧美多个发达国家中。目前，在欧美等发达国家及中国等主要的猪肉生产国中，人工授精技术在生猪繁殖的普及率在90% 以上。而猪精液保存水平的提高，是提高人工授精技术的首要环节，可以极大地提高公猪精液使用的时间性和地域性。

在20世纪30年代的前苏联，科学家率先进行了使用猪新鲜精液进行人工输精的试验并成功地产下仔猪，这是液态精液在猪人工授精成功使用的最早的报道。因为液态储存法保存的精子呈现活力活性高、授精成功率较高且操作快捷方便等优点，因此，液态保存的精液得到了了人们广泛的传播与应用，随后人们对于猪液态精液的保存技术研究更加精准，推动了该技术飞速发展。据有关数据表明，目前全世界每年都有将近1 000万头母猪利用人工授精来繁育仔猪，而其中绝大多数使用的是液态保存的精液，它们的受胎率均在75%~90%之间。随着现代交通运输业的不断发展，液态保存精液的高效便利与相对较低的成本等优点已经凸显出来，而这些优点是冷冻精液无法比拟的。猪液态精液应用于人工授精已经成为生猪生产的主要方式，在提高种公猪的利用效率，推动猪人工授精技术的发展中具有重大意义。

在20世纪50年代及以后，冷冻精液的使用在养牛业中取得了巨大成功，极大地激起了养猪业应用该技术的需求。因为猪精子在耐冻性上与其他家畜相比有着明显的个体差异，到20世纪70年代中期冷冻猪精液并没有直接被用于实际生产之中，而是在后来不断地技术创造革新发展后才被成功引进生产中。由于精液冷冻方法繁琐，冷冻精液活力、受胎率和产仔数等性能指标不理想，导致冷冻精液在商业应用中进展缓慢。近几十年来，美国及欧洲一些国家的猪精液冷冻技术迅速发展，其猪精液冷冻后的质量与牛相比已经非常接近了。但因猪冷冻精液的技术目前主要还是参照于牛冷冻精液的技术流程，且尚未有明确的针对猪精子的特性的冷冻程序及方法，目前的猪冷冻精液仍然存在冻融后活力下降，部分精子冷冻损伤，精子输送效率降低，在生殖道存活时间短等问题，加上冷冻程序繁琐，成本昂贵的因素，在猪场冻精的普及率上远远不如液态精液。对此国内外研究者开展了大量关于提高猪冷冻精液质量的研究，并取得了积极进展，比如通过向冷冻稀释液中添加某些物质用来提高猪精子冷冻-解冻后的质量。

2 应用

2.1 人工输精的进步

过去10年中，随着集约化生猪养殖场的不断发展，世界上主要的猪肉生产国中，猪人工授精的应用比例达到了90% 以上。在猪人工授精使用的传统方法是子宫颈输精法（CAI），即在猪子宫颈第2~3褶皱部位输入稀释好的精液，剂量一般是每次至少30亿个精子。而最新的猪子宫深部输精法(PCAI)，则是在将常规输精管插入子宫颈皱褶后，再插入比常规输精管长0.15～0.2 m的输精内管，由于其长度较长，形状较细，材质较软，因此它可以通过子宫颈皱褶进入子宫体，达到更加精准高效的输精效果。根据研究表明PCAI可直接将精液输送到子宫体，避免了精液滞留在子宫颈皱褶处，可以减少精液的使用量，大大减少了精液的浪费，其精液剂量只需要保证每份精液中精子总数在10亿个精子以上，即可达到与CAI相同的效果。近年来有实验室报道已将PCAI精子使用数降至5亿个也可达到相似效果。可见应用PCAI技术，养猪生产者可以使优质公猪的精液对更多的母猪进行人工授精，极大地降低了优质精子采购成本，提高了精子的利用率。但该技术目前也存在一些缺点，就是在后备母猪上操作难度大，输精管价格昂贵增加成本，而且如果操作不当会给母猪带来损伤，所以PCAI技术的应用仍然具有挑战性。而在公猪精液价格相对较低的国家和地区，PCAI似乎不太有吸引力。

2.2 性别分类控制技术

动物的性别分类控制技术是通过人为干预动物的正常生殖过程，使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术。性别控制技术在畜牧生产中有着重大的意义。通过控制后代的性别比例，可充分发挥受性别限制和影响的生产性状(如泌乳、生长速度、肉质等)的最大经济效益。目前性别分类技术在奶牛养殖业中的发展较为成熟，但是其在养猪业中的应用还不够全面。其实早在1991年，Johnson就报告了首例的猪精液性别分类方法，随后该技术进行了改进，筛选仪器、软件和精子分拣速度都有了进一步的发展，使其更适用于低剂量猪人工授精，但因为猪特殊的解剖结构，仍然需要大量精子用于子宫颈内人工授精，增加了养殖成本，从而限制了猪性别分类精子在生猪生产中的应用。2006年由中国科学家主持研究的，世界首例通过分离x、y精子的性别控制技术进行人工授精而获得的小水牛诞生。这种x、y精子分离技术被称为贝尔茨维尔精子性别鉴定技术，而后性别控制技术结合人工授精开始广泛应用于畜牧生产中。2009年中国首例性别控制猪在广西诞生，其中运用的性别控制技术与牛类似，即利用x精子和y精子之间DNA含量的差异，先将精液染色，然后利用x精子与y精子在流式细胞仪中的荧光强度不同，将两者分离，最后用于人工授精技术，向受体母猪中输入分离得到的x精子或y精子。但是在实验过程中，猪比牛更为困难，具体其原因有：1）有研究表明，猪的x和y精子之间DNA含量的差异小，只有3.6%，不容易分辨；2）猪精子在进行分离处理过程中极易受损，在分离过程中，精子会被稀释、染色、挤压、激光照射等处理，稍微有一点处理不当实验就会失败；3）猪的人工授精需求量大，需要长时间进行分离。目前，精子按性别分类，其产生效率只有每小时20亿～25亿个精子，生产效率不高，而且在分离过程中会损失相当数量的精子，从而产生相对较高的生产成本，加之由于猪人工授精技术的限制，当养殖场在现有条件下使用性别分类精子时，生育能力和产仔数都会受到影响，因此性别控制技术批量应用于生猪生产仍有一段路要走。

一些机构已经对性别冷冻精液进行了研究，这仍然是一件棘手的问题，因为从精子的保存方面来看，冷冻猪精子解冻后活力不高，而对精子的筛选又会不可避免地造成部分精子的死亡，加之较昂贵的成本成为阻遏该项技术发展的重要原因。所以不断优化性别筛选分类后猪精子的保存和使用技术，也是今后进一步的研究的方向。而对常规使用的猪精液冷冻保存技术的突破，可能会更好地促进保存性别分类精液的研究。

3 展望

在大多数猪肉生产国，保存的猪精液在人工授精中的应用已得到充分证实。随着对猪精液的分析、处理、智能管理和网络信息等新技术的创新发展，大大提高了具有良种优势的猪精液利用效率。而与有效表型特征相关联的DNA碱基选择工具的出现为进一步提高人工授精的效率提供了帮助。然而全世界人工授精（AI）中仅有1% 是用冷冻解冻的猪精子进行的，虽然冷冻储存的方法帮助了猪精子库的建立，并且可以保存遗传物质几十年。但有报告显示，将精子在液氮中进行长期储存会影响解冻后精子的质量。而冷冻保存程序造成的损害，会直接降低冷冻解冻的猪精子的受精能力和人工授精后的繁殖性能。这种低温损伤主要是由于猪精子对冷休克和过氧化损伤的高度敏感性，因为在其质膜成分中含有很高的不饱和磷脂和低胆固醇。因此，冷冻-解冻程序会导致精子膜失稳，从而影响钙均质酶、顶体完整性导致膜脂紊乱。但近年来猪冷冻保存技术有了飞速的进步，这些进步涉及冷冻保存程序之前的精子选择、冷冻和解冻延长剂的添加剂、人工授精技术的相关性和受精-排卵间隔，相信随着这些技术的进步能够进一步解决猪精子冷冻带来的损伤。在实际生产中，将科学研究与实际生产相结合是非常重要的，通过技术的进步引导产业的发展，将为我国恢复生猪生产提供良好的支撑。

对液体或冷冻状态下将性别分类的精子引入人工授精实践，也是为了实现生猪产业的复产扩繁这一目标。对猪来说，将精子进行性别分类后的活力与受精能力均低于直接进行人工授精的精子。但有实验表明，在一定条件下使用低至5×107的精子数目，仍然可以生产出所需性别的仔猪，结合目前子宫颈深部授精技术已经取得了一些成功，需要进一步努力开发出更加适用于使用低精子数进行 PCAI的导管。在对照实验中，使用特殊设计的导管可提高母猪的受孕率，减少对精子的浪费，提高利用率。而在这一研究领域的成功让性别分类精液在养猪业中广泛应用成为了可能。在K.Willenburg的报告中，总结了目前人们对猪的性别分类精液做出的努力，尽管之前相对较低的性别分类精子数限制了其在猪人工授精的应用，但随着科技的进步这一情况正发生着积极地改善。科学家们认为，通过筛选出来的猪性别精子可以战略性地应用于养猪业，以满足对雄性和雌性猪的不同需求。目前正在研究利用其他生物技术的最新进展，来替代目前流式细胞术的方法，这包括通过微流控制设备对精子进行分类，以金纳米颗粒为载体对单个精子进行序列特异性标记或基因编辑，以诱导SYR基因的敲除或干扰，并直接影响带有Y染色体的精子的功能。

目前，非洲猪瘟的全球蔓延对生物安全提出了挑战，对养猪业的发展造成了极大威胁。尽管疾病预防和检测技术在当前的形势下发挥了很大作用，但是抵抗关键病原体进入的全面保护机制，没有办法被充分保证。而引起母猪繁殖失败或严重疾病的病毒，如猪蓝耳病（PRRS）、猪流行性腹泻（PED）或 非洲猪瘟（ASF），很可能会通过临床上未确诊的公猪精液传播。现在CRISPR/Cas9技术可用于产生抗PRRS等病毒的公猪。如果实验用的公猪符合政府的规定，并且可以满足消费者的需求，那么对它们经过基因工程处理，可以极大地提高养殖场的生产力。如果相关实验人员使用纸质微流控设备和高速DNA扩增技术，对公猪精液进行多种病原体的快速现场诊断，那么其将成为性价比高、便于使用和有效预防猪病的最佳工具。随着冷冻精液技术的发展，可以将检测没有病原体的精液进行冷冻保存，使用这种方式可以安全而高效地应用于生猪生产中。