结合态氮对满江红内生细菌群落组成和结构的影响

陈 坚 陈 彬 郑斯平 郑益平 朱炳耀 郑伟文

(福建省农业科学院生物技术研究所, 福州 350003)

水生蕨类植物满江红(Azolla)广泛分布于温带和热带淡水生态系统。满江红俗称红萍、绿萍, 因富含氮素和蛋白质等营养成分, 在亚洲农村被用作绿肥和饲料已有数百年历史[1,2]。这种细小的植物繁殖快, 生物量高, 归因于其叶腔中栖息着一种固氮蓝藻。固氮蓝藻是属于革兰氏阴性细菌的光自养原核生物, 故又称蓝细菌(Cyanobacterium)。与满江红共生的蓝藻形态酷似念珠藻(Nostoc), 一般称为满江红念珠藻(Nostoc azollae), 是由多个细胞串联成的丝状体, 含有营光合作用的营养细胞和专司固氮的异形胞。异形胞含有编码固氮酶的nif基因, 可将大气氮转化为植物可利用的结合态氮, 以NH4的形态满足宿主生长对氮素的需求。宿主则以蔗糖为主的碳源作为回报[3,4]。研究表明, 添加结合态氮无助于满江红的生长, 甚至危及共生蓝细菌的生存[1]。这是因为结合态氮的存在不仅不利于蓝细菌的营养细胞分化为固氮的异形胞, 而且会抑制异形胞的固氮功能[5—8]。

自20世纪70、80年代曾经的“红萍热”以来, 本实验室和国内外的研究机构对满江红-蓝细菌共生固氮的基础生物学进行了多年持续的研究, 发现并证实满江红在长期的进化过程中形成了特殊构造,专供蓝藻栖息的叶腔和腺毛[9]。腺毛有两种: 发生于满江红叶原基的初生分支腺毛(Primary branched hair, PBH; 由一个基细胞和多个端细胞组成)和形成于叶腔的次生单支腺毛(Secondary single hair, SSH;仅由一个基细胞和一个端细胞构成)[10]。它们不仅是宿主与共生藻进行氮、碳等物质交换和信号传递的特殊结构, 又是共生藻在满江红的无性繁殖阶段从茎尖向叶腔, 从母体向幼体进行水平转移的纽带; 也是共生藻在满江红的有性繁殖阶段从茎尖向孢子果, 从亲代向子代进行垂直转移的桥梁[4,11—13]。满江红的这些特殊构造给共生藻以稳定和封闭的生存空间, 让蕨与藻终生相伴, 使两者共生关系世代永续。这正是满江红有别于地球上现有的植物-微生物共生固氮体系的独特之处[14]。随着满江红及其共生蓝藻全基因组测序的完成, 以满江红作为模式植物, 进行植物-微生物相互作用和微生态研究已日益受到学术界的关注[8,15,16]。

近30年来, 人们先后从满江红的叶腔发现并分离培养出其第三个共生伙伴——细菌。它们与固氮蓝藻一起构成了满江红叶腔内的微生态系统。而早在20世纪90年代, 6个国家9个实验室的研究者均以自然界的满江红作为研究满江红内生细菌的材料, 采用传统的平板培养法, 从4个生物种的满江红中分离鉴定出9个属15个种的内生细菌[17,25]。本实验室郑伟文等[12]用电子显微镜证明自然界的满江红和人工培养的无藻满江红均有伴生细菌。Nierzwicki等[20,21]应用电镜技术将满江红叶腔内生细菌分为6个超微结构类型。这些研究均从形态结构方面反映了内生细菌的多态性。进入21世纪后,随着分子生物学技术的进步, 美国Raensallae大学的Lechno等[26]用rDNA-PCR 等方法从卡洲满江红的叶腔中分离鉴定出根癌农杆菌、根瘤菌等4种细菌。本实验室郑斯平等[27]用PCR-DGGE和电镜技术对满江红的叶腔和孢子果内细菌的进行了检测和观察, 揭示了小叶满江红叶腔以变形菌门为主的多种可培养和不可培养的细菌, 把对满江红内生菌的表型多样性的研究推进了一步。随后, 郑斯平等[28]将小叶满江红的内生菌经16S rDNA-PCR扩增后用T-RFLP技术和PAT软件分析, 通过比对确定这些内生菌属于10科42属。

本文报道用高通量测序和电子显微镜技术研究结合态氮对满江红体内以共生蓝细菌为优势的内生细菌群落的遗传组成和物理结构的影响, 及其对满江红形态建成的间接效应, 试图为通过内生菌群落结构的调节进而改变宿主的生长发育提供新的线索与思路。

1 材料与方法

1.1 材料来源与制备

本研究的实验材料为小叶满江红(Azolla microphyllaKaulfus), 早先从国际水稻研究所(International Rice Research Institute)引进, 原编号为IRRI 4018。

表面灭菌的满江红制备为了排除外源细菌等微生物的干扰, 参照白克智等[29]的茎尖培养法,略有修改, 具体如下: 取100 g(鲜重)在自然条件下生长的萍体, 用自来水清洗, 去掉黏附的土壤等杂物, 细心剪去根系。后选取健康的萍体再用无菌水清洗。捞取洗净的健康萍体, 置于灭菌的烧杯中,加入适量的0.1%升汞溶液, 将萍体浸没, 用灭菌的镊子连续搅拌3min30s, 使满江红的叶、茎和幼根充分与溶液接触, 以确保灭菌效果。随后倾尽升汞溶液, 迅速用无菌水清洗经灭菌的萍体, 至少清洗4次, 每次3min, 尽量洗去残留在萍体上的升汞。在立体解剖镜下用无菌的细针挑取并弃去包被茎尖的叶片, 仅保留茎尖分生组织和1—2个叶原基, 后投入灭菌的IRRI无氮培养液的三角瓶内。IRRI培养液的配方为(mg/L): NaH2PO4·H2O 89; K2SO489.1;CaCl2·2H2O 147; MgSO4·7H2O 405.3; MnCl2·4H2O 1.8; Na2Mo2·2H2O 0.38; H3BO31.14; ZnSO4·7H2O 0.04; CuSO4·5H2O 0.04; CoCl2·6H2O 0,04; EDTAFe (FeSO4·7H2O 0.249, EDTA 0.261, KOH 0.157)。培养液ppH6.5。

无藻满江红的制备取以上述经表面灭菌并洗净的萍体, 将按上法剥离的茎尖分生组织逐个分别接入装有Nickell培养液的三角瓶中培养。Nickell培养液的配方是(mg/L): KNO3202; KCl 150;KH2PO4 136; Cu(NO3)2·4H2O 708; CaCl2167;MgSO4·7H2O 246; MgCl296; H3BO30.1; MnSO4·4H2O 0.1; ZnSO4·4H2O 0.3; CuSO4·5H2O 0.1; Na2MoO4·2H2O 0.1; EDTA-Na2370; FeSO4·7H2O 280。培养液pH 6.5。

以上操作均在本研究所组培实验室的无菌环境下(苏净SW-CJ-2F型)完成。培养条件为: 26℃/18℃(日/夜), 光强550 μmol/(m2·s)。10—15d更新培养液。待繁殖足量后分别称取样品用于下一步的实验。

1.2 扫描电镜样品制备与观察

选取上述满江红植株的营养体, 在解剖镜下细心去除根系后, 将剥离的萍体用2.5%戊二醛溶液(0.1 mol/L磷酸缓冲液, pH7.4)在室温下固定4h, 用同样的磷酸缓冲液洗涤3次后, 用2%锇酸在4℃下固定2h, 又经磷酸缓冲液充分洗涤后, 用乙醇逐级脱水, 并经环氧丙烷替换两次。试样用HCP-2型临界点干燥器干燥, 将经干燥的样品黏附于铜台上,在高倍解剖镜下用细针解剖, 使满江红叶腔内的微生物群落充分暴露, 再用IB-5型离子溅射仪喷镀铂钯, 用JEOL JSM-6380lv 型扫描电子显微镜观察并拍片, 加速电压15 KV。

1.3 满江红DNA提取与16S rRNA基因和nif基因的PCR扩增

采用DNA提取试剂盒(上海生工) 和说明书的操作步骤提取样本的DNA, 用0.7%琼脂糖凝胶电泳对检测所提取DNA的完整性。

以提取的满江红基因组DNA为模板, 在ABI GeneAmp®9700型反应仪上进行PCR反应。细菌16S rDNA引物为: 338F(5′-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3′), 806R(5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3′), 反应体系20 μL, 包含: 4 μL的5×FastPfu Buffer; 2 μL的2.5 mmol/L dNTPs; 各0.8 μL的正向扩增引物 (5 μmol/L) 及反向扩增引物(5 μmol/L); 0.4 mL TransStartFastPfu聚合酶; 0.2 μL BSA; 10 ng模板 DNA; 补ddH2O至20 μL。PCR反应参数为:95℃预变性3min, 27循环(95℃变性30s, 55℃退火45s, 72℃延伸1.5min); 72℃延伸 10min。

nif基因的扩增引物为nifH-F(5′-AAAGGYGG WATCGGYAARTCCACCAC-3′),nifH-R(5′-TT GTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′)。PCR反应参数为: 95℃预变性3min, 35循环(95℃变性20s, 55℃退火45s, 72℃延伸1min), 72℃延伸10min。

PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测后, 委托上海美吉生物科技有限公司用Illumina的MiSeq测序仪对rRNA基因的扩增序列进行高通量测序。

1.4 数据处理与生物信息学分析

用Flash软件对Miseq测序得到的PE reads根据overlap关系进行拼接, Trimmomatic软件对拼接序列质量进行质控和过滤, 获得高质量的Tags序列。在Usearch(vsesion 7.0)平台, 按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行操作分类单元(Operation taxonomic unit, OTU)聚类, 在聚类过程中去除嵌合体, 得到OTU的代表序列。为了得到每个OTU对应的物种分类信息, 基于silva数据库, 采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析, 并分别在从域(Domain)到种(Species)各个分类学水平统计各样本的群落组成。分析在美吉生物科技有限公司的生物云平台(i-sanger)上完成。

2 结果

2.1 表面无菌的含藻满江红与无藻满江红的获得与验证

得到植株表面无外源微生物污染, 但叶腔仍含有共生蓝藻(下称symbiont或cyanobiont)为优势种的内生细菌群落的满江红样本是进行本研究的前提。参照白克智[29]的方法, 经过近2个月的茎尖组织培养, 取得了在IRRI无氮培养液正常生长的小叶满江红群体, 成功率为10%。验证方法有三: (1)培养60d后, 培养液洁净通透, 未见污染; (2)用扫描电镜随机检查10株萍体及其根系, 萍体叶片, 尤其是根毛间隙未见到任何细菌(图 1), 而叶腔中以共生蓝细菌为主的内生细菌群落与自然界的满江红叶腔菌落无异(图 3)而在自然条件下生长的满江红,可见细菌附着于植株, 尤其是根表皮细胞(图 1)。通过茎尖组织培养也取得了在Nickell富氮培养液健康生长的萍体。成功率为5%。验证方法同上。即培养60d后, 结合态氮丰富的Nickell培养液依然澄清洁净, 叶片和根表未见微生物存在, 且叶腔内未见Nostoc azollae存在的迹象(参见2.2); (3)用nifHPCR和测序检测(详见2.3和2.4)。电镜观察和nifHPCR检测结果均表明本研究采用的方法是成功的。本文将表面无菌、叶腔中含有以Nostoc azollae为优势的微生物群落、nifH-PCR检测阳性的满江红, 简称为含藻满江红(Azollawith symbiont), 叶腔中未见共生藻且测序检测无Nostoc azollae者即称为无藻满江红(symbiont-freeAzolla)。

图 1 满江红根部表面的扫描电镜照片Fig. 1 Images of the root surface of Azolla by SEM

氮素对满江红表观形态的建成有明显的影响。如图 2所示, 在无氮条件下生长满江红样品(AmA)的萍体大小和叶片间距分别比无藻满江红(AmB)大约20%和15%。而后者背叶裂片上的乳头状突起(papillae)明显凸起, 前者却略显扁平。用扫描电镜对叶腔的观察表明: 添加结合态氮并不影响满江红叶腔和腺毛的发生, 但对其中存在的共生蓝藻Nostoc azollae却发生了可鉴别的变化, 即在自然及无氮生长条件下明显可见的共生蓝藻全部消失。

2.2 含藻满江红与无藻满江红叶腔微生物群落的形态结构比较

利用扫描电镜对含藻满江红与无藻满江红叶腔中微生物群落的形态做进一步观察(图 3—6), 可以看到两者有如下差别: (1)含藻满江红叶腔中以Nostoc azollae为优势的内生菌占据了大部分的可用空间。由异形胞(小五星标志)和营养细胞组成的蓝藻丝状体缠绕于叶腔约15个单支腺毛细胞之间,并彼此连接成网络状结构; 在其幼叶(叶龄为第2到第5叶),叶腔内的细菌大多附着于蓝藻细胞上, 或彼此聚集形成类似生物被膜(biofilm)的构造, 厚度约1 μm。众多的蓝藻和细菌细胞包埋在由多种分泌物构成的基质中(大星形标志, 图 4)。在成熟的叶腔(叶龄一般在在第6—7叶以上, 此时叶腔开口完全封闭) 蓝藻和细菌等微生物与叶腔内的腺毛紧密结合, 形成一个大小与叶腔相适配的椭球形藻囊(Algal pocket), 外由一层约50 nm的薄膜包裹(图 6)。打开藻囊, 可见腺毛和藻、菌等相互交织, 形成多层次、多种结构的生物被膜, 厚度可达2—5 μm(另文报道); (2)无藻满江红的从幼叶到老叶, 除了环绕在叶腔周围的腺毛外, 均未见Nostoc azollae。在低倍放大的电镜视野中, 叶腔基本是中空的(图 3)。在高倍放大的电镜视野中, 可以看到形态各异的细菌附着于无藻满江红叶腔的腺毛细胞表面或分散在叶腔内壁上, 但未见生物被膜存在, 更没有形成藻囊结构(图 5)。

图 2 含藻满江红(a)与无藻满江红(b)的表观形态(扫描电镜照片, 标尺=1 mm)Fig. 2 The morphological appearance of Azolla with the symbiont(a) and symbiont-free Azolla (b) by SEM (Scale bar=1 mm)

2.3 内生微生物的16S rRNA和nifH基因的PCR扩增

应用基因组试剂盒对含藻和无藻满江红提取总DNA, 分别以细菌的16S rRNA基因和nifH基因的区段设计引物, 以提取的DNA为模板进行PCR扩增。扩增结果由图 7可见: 泳道1—4均在500 bp附近扩增出单一的DNA条带, 表明在满江红的培养基中无论是否添加氮素, 其内生的细菌群落均具有16S rRNA基因和nifH基因区域的特异性扩增。

2.4 满江红内生细菌16S rRNA基因和nifH基因扩增产物样本的测序数据

对分别在无氮和富氮两种培养模式下的满江红样本不同细菌群落的PCR扩增产物进行高通量的测序分析, 将得到的代表16S rRNA基因和nifH基因区段的样本测序数据总结在表 1中。

图 3 扫描电镜照片显示结合态氮对满江红茎尖区域共生藻的抑制效应Fig. 3 The inhibitory effect of conbined nitrogen on the symbionts at the apical region of Azolla frond analyzed by SEM

图 4 含藻满江红叶腔剖面的扫描电镜照片Fig. 4 The profile of the fourth leaf cavity within the Azolla with symbiotic caynobacteria by SEM

由表 1可见: 通过对细菌16S rRNA基因的可变区和固氮菌nifH基因区段的扩增产物进行高通量测序, 对读取的序列PE reads进行拼接, 质控和过滤后, 获得标签Tags序列。从生长于无氮培养基的满江红样品(AmA)以及生长于富氮培养基的满江红样品(AmB)所得到的标签序列的数量, 碱基数, 序列的平均长度及长度范围比较而言, 两者间差异并不大, 即使有所差异也无实际意义。但在Usearch(vsesion 7.0)平台, 按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行操作分类单元(Operation taxonomic unit, OTU)聚类后, 可以看出, 在富含结合态氮的Nickell培养基中生长的满江红(AmB), 其基于≥97%的相似度水平, 通过聚类分析共获得的有效OTUs的数目大幅度的减少, 其中以16S rRNA基因为标记的OTU减少了53%; 以nifH基因标记的OTU减少了64%。由于IRRI培养基和Nickell培养基除氮素外, 其余培养成分基本相同。测序结果表明: 结合态氮对满江红内生细菌无论是总菌群和固氮菌群的多样性的减少起到了关键的作用。

2.5 含藻满江红与无藻满江红的细菌群落组成

为了得到每个OTU对应的细菌物种的分类信息, 基于silva数据库, 采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析,分别在各个分类学水平: Domain(域)、Kingdom(界)、Phylum(门)、Class(纲)、Order(目)、Family(科)、Genus(属)、Species(种)统计出各样本的群落组成,在各个分类水平上进行群落结构的分析。

图 5 无藻满江红第四叶叶腔横剖面的扫描电镜照片Fig. 5 The cross profile of the fourth leaf cavity of the cyanobiontfree Azolla by SEM

图 6 含藻满江红第七叶叶腔剖面扫描电镜照片Fig. 6 The profile of the seventh leaf cavity within Azolla with the symbiont by SEM

图 7 满江红内生细菌的PCR扩增产物的电泳图谱Fig. 7 PCR products amplified from endophytic bacteria of Azolla

对16S rRNA基因标记的全细菌群落的结构分析表明(图 8): 生长在无氮和富氮两种培养条件下的满江红叶腔中细菌群落的组成差异很大。在无氮条件下生长的满江红(AmA)中检出17个OTU, 分属于4门: 蓝藻门Cyanobacteria(52.5%)、变形菌门Proteobacteria(47.4%)、硬壁菌门Firmicutes(0.059%)和拟杆菌门Bacteroidetes(0.0016%)。有2个OTU分别属于蓝细菌菌门Cyanobacteria的蓝细菌目(10.44%)和未命名的Subsection IV目; 有11个分别属于变形菌门中的草螺菌属Herbspirillum(28.54%)、Niveispirillum菌属(6.78%)和根瘤菌属Rhizobium(4.42%);以及乳酸杆菌属Lacibacterium、鞘脂单胞菌属Sphingomonas、大肠杆菌志贺菌属Escherichia-Shigella、嗜甲烷菌属Methylophilus、红螺菌属Rhodospirillales和假单胞菌属Pseudomonas; 有3个属于厚壁菌门Firmicutes的小杆菌属Dialister(嗜血杆菌族)、链球菌属Streptococcus和粪便杆菌Faecalibacterium。还有1个属于拟杆菌Bacteroidetes中Bacteroides属。而添加氮营养明显降低了满江红内生细菌的多样性。其内生细菌种类明显减少, 为8个OUTs, 分属于4门。即蓝藻门Cyanobacteria(86.79%), 均属于蓝藻目Cyanobacteria, 其余为变形菌门(13.12%)、放线菌门(0.061%)和厚壁菌门(0.038%)。与AmA相比, 属于未命名Section Ⅳ目的蓝细菌消失了。此外, 添加结合态氮也降低了变形菌门细菌的多样性,其中具有固氮能力的草螺菌(Herbaspirillum)、Niveispirillum和根瘤菌(Rhizobium)等属的细菌基本消失, 而假单胞菌(Pseudomonas)属的成员成了优势菌(12.9%)。前三者菌在AmA中分别占有28.6%、6.7%和4.4%; 后者仅占3.67%。

表 1 不同满江红样本的两种细菌基因扩增区段的测序数据统计Tab. 1 The summarized sequencing data of amplified fragments of two bacteria genes from different Azolla samples

图 8 两种满江红样品16S rRNA基因的内生细菌在属水平的群落丰度的百分比Fig. 8 Percent of community abundance of the endophytic bacteria in two Azolla samples based on 16S rRNA gene at genus level

2.6 nifH基因鉴别的内生菌群落组成

16S rRNA基因扩增产物的测序结果表明, 在富氮培养基生长的无藻满江红样品(AmB)中仍检出了蓝细菌, 且占优势。这些蓝细菌是否固氮的Nostoc azollae? 本研究对固氮酶基因nifH的检测给出了答案。

测序结果表明, 从含藻满江红样品(AmA)中得到36959条序列, 而无藻满江红(AmB)也得到38869条序列。但两者间的微生物的可操作分类单元(OTU)明显不同, 前者nifH测序序列形成14个细菌的OTU, 满江红共生体的nifH基因主要来自蓝藻门, 变形菌门和未知细菌的门类。其中蓝藻门的nifH基因的细菌群落占了88.44%的优势, 划分到种属水平均为满江红的共生蓝藻Nostoc azollae, 变形菌门中含有nifH基因的细菌群落占了11.32%, 包括固氮的草螺菌(Herbaspirillum)、Niveispirillum和根瘤菌(Rhizobium)。在门水平无法认定的固氮菌为0.23%。后者仅有5个OTUs, 来自变形菌门(99.71%)和未知门类的细菌(0.29%),Pseudomonasstutzeri占99.54%, 还有0.16%含有nifH基因的细菌落无法认定到纲的水平。值得注意的是蓝藻门的nifH基因未检出。这就是说从无藻满江红(AmB)16S rRNA基因扩增产物检出的蓝藻并不是固氮的Nostoc azollae(图 9)。

3 讨论

3.1 结合态氮对Nostoc azollae的抑制效应

自从白克智等[29]开发出茎尖培养技术以来, 经本实验室略加改进后一直用此法获得无藻满江红。比较IRRI和Nickelle培养液的化学组成, 两者的主要差别在后者含有较多的结合态氮[KNO3,Ca(NO3)2], 表现出对共生蓝藻的显著抑制作用。为此我们通过剥离包裹共生蓝藻的幼叶, 让Nostocazollae与和Cu2+充分接触。据我们观察, 附着于茎尖的蓝藻藻殖段(Homogonia)并不含异形胞(图 3), 且生命力强。如不将之充分暴露于它们可能存活下来。Li Fay-Wei等[8]报道, 在培养液中添加NH4NO3可使满江红体内的共生蓝藻消失,以致无法用PCR检出nifH。我们也曾做了同样的尝试, 但经过连续的继代培养后其共生蓝藻又“复活”了。而在Nickelle培养液生长的无藻满江红投入无氮的IRRI培养液则难以存活。这说明在结合态氮的“压力”下, 满江红叶腔中绝大部分的蓝藻消失了,但仍有极少数的蓝藻细胞存活下来。

图 9 两种满江红样品含nifH基因细菌在属水平的群落丰度的百分比Fig. 9 Percent of community abundance of the endophytic bacteria in two Azolla samples based on nifH gene at genus level

值得指出的是, 在无藻满江红体内尽管未检出固氮的Nostoc azollae, 但仍有相当数量其他不固氮的蓝藻存在。这一结果颠覆了长期以来的人们关于满江红的内生藻就是Nostoc azollae的认知。我们曾用荧光显微镜和电镜观察到叶腔中无异形胞的蓝藻(另文报道)。所以严格说来, 所谓含“藻”满江红和无“藻”满江红严格地说应是含Nostoc azollae和不含Nostoc azollae的满江红。而以往文献中常用的Azolla-Anabaenasymbiosis 或Azolla-Nostocsymbiosis的提法也值得推敲。

3.2 结合态氮对满江红叶腔中微生物群落组成的影响

本研究用I11umina MiSeq高通量测序平台对细菌的rRNA基因的可变区进行了序列测定。这在很大程度上提高了对细菌群落组成进行定性与定量的精确度。通过序列的算法分析, 在聚类过程中去除嵌合体, 可以比较准确地得到OTU的代表序列,从而比较精确地确定其对应的物种信息, 还可以依据测序序列read的数量, 统计它们的相对丰度。

本研究结果再次证明, 在无氮条件下生长的小叶满江红(A. microphylla)含有数量和种类众多的以蓝细菌占优势的内生细菌。用高通量测序技术检出了横跨四个门类的细菌, 仅变形菌门就有11个属,还有大量不可培养的细菌种类, 目前为止从满江红中检出细菌的门类最多。本实验室郑斯平等[28]用T-RFLP技术和PAT软件, 分析结果表明从小叶满江红中有41个属的细菌, 但大部分属于变形菌门。Laerua等[30]用宏基因组测序技术和相关软件分析,从蕨状满江红(A. filiculoides)也检出以Nostoc azollae为优势(60%—75%), 包括变形菌门、拟杆菌门和放线菌门的内生细菌。这两种满江红内生菌的主要类群相似。

值得注意的是, 我们在含藻满江红叶腔中除了固氮的Nostoc azollae外, 也检出了固氮草螺菌(Herbasprillium)、Niveispirillum和根瘤菌(Rhizobium)等固氮细菌。Laerua等[30]也报道了包括蕨状满江红和小叶满江红在内的地球上现存的7种满江红叶腔中均有根瘤菌(Rhizobium)存在, 但没有说明是否有其他固氮细菌或蓝细菌被检出。至于在用Nickell培养液培养的萍体样品中nifH基因来自Pseudomonasstutzeri, 其潜在作用有待进一步研究。

如上所述, 无藻满江红均未检出固氮的Nostoc azollae以及固氮草螺菌(Herbasprillium)、Niveispirillum和根瘤菌(Rhizobium)等固氮细菌。由于缺乏这些原先可以提供结合态氮的微生物, 势必颠覆无藻满江红及内生细菌的氮代谢通路, 从而从根本上改变内生细菌的群落构成。由于内源氮素基本被切断, 其内生菌种类和数量的变化在所难免。

3.3 结合态氮对满江红表型结构的影响

从形态学的角度来看, 结合态氮导致共生藻Nostoc azollae从满江红叶腔内消失, 进而使与Nostoc azollae共存的内生菌数量种类明显减少, 未能形成生物被膜和藻囊。生物被膜(Biofilm)是多种微生物聚集并包埋在自身分泌的胞外高分子基质(Extracellular polymeric substances, EPS)中的一种构造, 其性质完全不同于自由散在的微生物细胞群体[31]。本研究揭示的满江红叶腔中的生物被膜可能比一般所称的生物被膜更为复杂。因为除了蓝藻、细菌等微生物外, 它还包含真核宿主的腺毛细胞及其分泌物。这种生物被膜的形成和发生不仅有利于微生物自身的生长繁衍和物质、信息交换,也势必对宿主满江红的生长发育乃至抗逆等方面都会有正面的促进作用。藻囊是迄今为止植物共生固氮体系中最为特殊的共生结构。它作为腺毛、蓝藻、细菌等多种微生物相互交织、互利互惠、可实现囊内物质循环的相对独立的实体结构, 又通过腺毛与宿主进行物质和信息交换, 形成错综复杂的交互网络。这是无藻满江红无可比拟的。所以含藻满江红个体比无藻满江红大且肥厚就不足为奇了。

总的来说, 结合态氮把Azolla-Nostoc azollae共生固氮体系还原为“纯粹”的蕨体。原先互惠互利的碳氮代谢通路已不复存在。无藻满江红需要依赖外源结合态氮才能存活。从表观上看, 无藻满江红个体变小了, 叶片因为缺少藻囊而变得更“紧凑”了, 甚至连叶表的乳头状突起也有某种程度的“修饰”。这启示我们: 通过改变植物的共生伙伴和内生菌群落结构有可能改变植物的表型和生存方式。深入探讨和比较含藻满江红与无藻满江红的生长速度、营养品质及其影响因子的分子机制, 有望为作物增产和品质改良提供新的线索和思路。