酶在液体洗涤剂中的稳定性研究进展

靳计灿，刘海峰，黎根盛，李瑞，林锐，曾晖，张少雄

(1.中山大学 化学工程与技术学院，广东 珠海 519082；2.中山大学 广东新材料产业基地联合研究中心，广东 佛山 528244；3.华南农业大学 材料与能源学院，广东 广州 510640；4.广东优凯科技有限公司，广东 佛山 528244)

由于人们对绿色洗涤剂产品需求的提高，而酶制剂正是绿色化学工艺中的理想催化剂[1]，这就为含酶洗涤剂的发展提供了契机。对于洗涤剂用酶，可以追溯到20世纪60年代，丹麦诺沃公司推出了一种来自地衣芽孢杆菌的细菌内蛋白酶，作为洗涤配方的成分[2]，使洗涤用品的去污效果得到大大提高。初期的洗涤产品大部分都是粉末，随着包裹造粒等技术的发展，使酶与洗涤配方体系中的组分相隔绝开，减少了酶与其它组分的接触，从而使粉状的洗涤产品的酶稳定性问题得到了解决。但是随着粉状洗涤剂向液体洗涤剂的转变，酶的稳定性问题再一次成为了人们关注的焦点，成功地使用酶助剂已经成为生产具有成本效益、对环境无害的驱动力，酶制剂的加入对于各类型洗涤产品的创新发展均具有很大的助推力[3]。但是酶制剂因为其生物属性使其在洗涤剂工业应用中特别容易受到外界影响而失去活性。所以，研究酶在洗涤剂溶液中(主要是表面活性剂溶液)的稳定性，探讨洗涤剂配方组分的表面活性剂等组分对酶的活性的影响，是一个非常重要的课题。

本文主要介绍了近年来酶在表面活性剂溶液中的稳定性研究进展，并进一步探讨了复合酶在液体洗涤剂中的稳定性问题，对酶在洗涤领域的相关应用进行了展望。

1 单一酶在表面活性剂溶液中的稳定性

为了使酶制剂在洗涤或清洁剂中使用，其存储期间的稳定性和清洁性能在很大程度上取决于各个组分的混合物[4]，其中表面活性剂是洗涤剂中最关键的组分，是洗涤剂中的重要去污组分，但是表面活性剂与酶之间的相互作用，能够使酶结构发生变化使其失活[5]，所以探讨不同洗涤剂用酶在表面活性剂溶液中的稳定性是一个非常重要的研究课题。

1.1 蛋白酶

蛋白酶是催化肽键水解的一类酶[6]。在洗涤剂种类中，蛋白酶可以说是最重要、应用最广泛的酶，这是因为像奶、血、汗渍等蛋白质占据了织物污垢的大多数，而且表面活性剂和其他助洗剂很难将其去除。在很多文献的研究中，对于含酶洗涤剂配方体系，蛋白酶对于阴离子型表面活性剂的敏感性特别大，相对于阴离子表面活性剂，非离子表面活性剂引起的问题要少得多[7]。

杨庆利等[8]研究了常用的阴离子表面活性剂对液体蛋白酶的影响，发现了在液相混合组分中，由阴离子表面活性剂所电离的离子所带的电荷会导致蛋白质空间结构发生变化，并且其疏水基团和亲水基团可能会分别与酶分子相互作用，从而影响酶活性。实验结果显示，各表面活性剂影响程度如下：LAS>AOS>AES>AEC，可以看出AEC的离子强度以及表面活性剂分子与酶的作用力相比其他表面活性剂来说是最弱的。

吴美娜等[9]基于洗衣液的主要成分考察了表面活性剂AES、AEO、APG等对蛋白酶活性的影响，结果分析可知，添加非离子表面活性剂吐温系列和APG系列的酶活性低于添加硼砂稳定剂的酶活，但是优于空白试验的酶活，可见系列非离子表面活性剂对酶活的稳定性保持起到了一定的作用；非离子表面活性剂AEO7和AEO9对于酶的活性基本没有影响，但是酶分子与阴离子表面活性剂AES之间的相互作用会显著降低酶的活性，而且对于混合表面活性剂体系，在未来可以增加 AEO与APG的混合使用，因为AEO与AES的混合使用并不会有效地提高液体酶的活性。

目前，很少有人对酶与表面活性剂之间的相互作用进行系统的研究，所以表面活性剂是怎么与酶相互作用使其失活的，这仍然是该领域面临的一个重要挑战。Zhang等[10]研究了AES、AEO、APG表面活性剂的结构对蛋白酶活性的影响，结果表明，阴离子表面活性剂LAS对酶活的影响最大，这主要是因为其结构中存在苯环；非离子表面活性剂AEO系列对酶有较小的影响，且其结构中环氧乙烷的个数越多，对酶的影响就越大；APG非离子表面活性剂比AEO对酶的影响还小，原因是除了其无法在水溶液中进行电离之外，还有就是在相同的疏水基团下，葡萄糖亲水基团比环氧乙烷基团对蛋白酶的影响更小。

关于含酶洗涤剂的开发，探索更适合洗涤环境的酶也十分重要。Haddar等[11]选用来自于莫来芽孢杆菌A21的两种丝氨酸碱性蛋白酶(BM1和BM2)，发现两者在洗涤剂浓度下对于吐温80和Triton X-100此类的非离子表面活性剂均显示出高稳定性，其中BM1和BM2两种蛋白酶的最适宜的pH值分别是8～10和10，在高碱性条件下能保持高活性的特性使其成为理想的酶制剂。

1.2 脂肪酶

脂肪酶能够将天然底物油脂催化降解成脂肪酸等物质，譬如油渍类的污垢就能够被有效的去除[12]，由于脂肪酶的这种特性，越来越多的研究开始将脂肪酶应用到其高端洗涤产品中。关于表面活性剂对脂肪酶活性的影响，人们探讨最多的还属阴离子表面活性剂，该类表面活性剂由于具有优异的清洁性能和相关的低生产成本，被用于大多数洗涤剂配方中，特别是那些具有脂肪族十二烷基的表面活性剂，由于在乳化效率和水溶性之间的折衷性，这些表面活性剂是首选的。在众多表面活性剂中，十二烷基硫酸钠(SDS)和具有两个EO单元的十二烷基醚硫酸钠(SLE2S)，是工业应用中常见的表面活性剂，由于其结构相似(见图1)，所以Magalhaes等[13]从表面活性剂的结构对酶的活性的影响进行研究，评估了阴离子表面活性剂的乙氧基团(EO)对脂肪酶的结构和活性的作用，在上述两种表面活性剂的存在下，评估蛋白质的构象变化和酶活性。结果表明，表面活性剂中的EO单元的存在决定了酶的稳定性和活性，SDS促使酶的变性和相应的活性损失，而SLE2S保持酶的结构和活性；该项工作的实验数据也进一步强调了蛋白质基团之间的静电相互作用，因吸附的阴离子表面活性剂的存在而发生改变，这种吸附主要是由疏水相互作用驱动的。

图1 十二烷基硫酸钠(SDS)和十二烷基醚硫酸钠(SLE2S)的结构图[13]Fig.1 Structural diagram of sodium dodecyl sulfate(SDS)and sodium dodecyl ether sulfate(SLE2S)

Nerurkar等[14]选择了一种从海洋细菌提取的脂肪酶作为酶添加剂掺入洗涤剂溶液，考察了在1%(w/v)的酶浓度下与不同的表面活性剂和洗涤剂在40 ℃下孵育1 h的效果，结果表明脂肪酶活性在表面活性剂(山梨醇酐油酸脂Span-80、三聚磷酸钠)、水柔软剂(硫酸钠)、氧化剂(过硼酸钠四水合物)和AATCC洗涤剂的存在下与空白对照样品对比是增加的(图2)，在此基础上又考察了其去除玉米油的效率，发现在洗涤剂中添加脂肪酶显著提高了织物上玉米油的去除效率(约20%)；而且该脂肪酶具有碱性最适pH值以及在广泛的温度范围内仍能保持高活性、高稳定性，说明该类脂肪酶适合用作洗涤剂配方中的添加剂。

图2 不同表面活性剂和洗涤剂对脂肪酶活性的影响[14]Fig.2 Effects of different surfactants anddetergents on lipase activity

1.3 淀粉酶

淀粉酶能够将大分子的淀粉催化水解成小分子的还原糖等物质，所以将其应用于洗洁精中，可有效去除含有淀粉基的污渍，如盘子上的米糊，糊状的马铃薯等。基于此，叶飞燕[15]研究了洗洁精中常用的表面活性剂对液体淀粉酶的稳定性影响，结果表明几种表明活性剂对酶的负影响程度为LAS>AOS>AES>AEO9，不过非离子表面活性剂AEO9与LAS复配后会显著提高酶的稳定性，而且在配方体系中加入稳定剂氯化钙，能够显著提高酶的稳定性，推测可能是由于钙离子与酶的结合对酶的活性有激活作用[16]。Singh等[17]测定不同浓度的表面活性剂和酶复配后的生物降解性，发现含有1%淀粉酶和0.118 g十二烷基硫酸钠的样品以及含有1%淀粉酶和2.7 μL吐温20的样品生物降解性最小，因此，该浓度的淀粉酶和表面活性剂复配体系可以用于具有高降解性的洗涤剂配方。

1.4 纤维素酶

纤维素酶可以有效地将纤维素分解成寡糖或单糖，可除去微纤维和附着在微纤维上的颗粒污垢，对织物表面起更新作用。纤维素酶被添加到洗涤剂中，可提高织物的平滑度，而不会对其造成损害，从而保持织物的质量[18]。在表面活性剂溶液条件下，研究其与纤维素酶的作用机理有一些报道，但是很少有报道用相应的表征手段对其作用机理进行合理的解释，于跃等[19]通过动态光散射(DLS)、荧光光谱及傅里叶变换衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR)探讨了表面活性剂和纤维素酶的相互作用机理，DLS实验结果表明在阴离子表面活性条件下，阴离子表面活性剂的磺酸基团具有较大的电离度，极大地促进了酶分子表面与表面活性剂之间发生吸附作用，进而改变了纤维素酶的结构，所以研究体系中的Zeta电位分布在较低的负电荷区域；而非离子表面活性剂-纤维素酶与蒸馏水-纤维素酶体系中的Zeta电位的分布没有明显的区别，主要是因为非离子表面活性剂与酶分子之间的相互作用依靠于氢键，并不会导致纤维素酶结构发生变化，且非离子表面活性剂亦不会电离出带电荷的离子基团来影响酶分子结构。荧光ATR-FTIR 实验说明了阴离子表面活性剂对纤维素酶的二级结构和侧链的微环境都有很大的影响；在很多洗涤剂配方中含有不止一种类型的表面活性剂，而且混合物表面活性剂相比仅含有单一种类的表面活性剂其CMC值会有所降低且性能更好[20]，所以在该项工作中还测试了混合表面活性剂对酶的影响，实验中采用阴离子表面活性剂AES(2EO)和非离子表面活性剂AEO2复配，结果显示，加入AEO2能够显著地改善AES(2EO)与纤维素酶的兼容性，这主要是因为复配后形成了混合胶束，在以阴离子表面活性剂为主的胶束中插入了非离子表面活性剂，使相邻分子间的电荷斥力降低，从而形成了更小的胶束，而且胶束的电荷密度降低，对酶活力影响变小[21]。

由于生产成本较高，纤维素酶的利用受到阻碍，未来的趋势是开发木质纤维素生物质和绿色生物技术[22]，以实现可持续增长。因此，寻找具有更好特性的纤维素酶是一项持续的工作。

2 复合酶在表面活性剂溶液中的稳定性

很多含酶洗涤剂只含有单一种类的酶，但是单一种类的酶无法去除多种污垢，这是因为酶催化反应具有专一性，在工业生产中只添加一种酶制剂是无法生产出高效去污的产品。因此，在洗涤产品中需要加入多种酶，比如纤维素酶与其他酶进行 1∶1 复配时，去污效果得到了显著的提升，这是因为复配酶中的纤维素酶能够使织物的纤维结构蓬松起来[23]，使其它酶能够充分地与嵌入在纤维结构中的污渍相互作用，进而提高了其去污的效果。张红艳等[24]以碱性蛋白酶的相对活性作为衡量指标，研究了8种常用表面活性剂在不同体系下对去血渍复合酶活性的影响，结果表明，在这些表面活性剂中，有7种表面活性剂可以很好的与酶稳定的共存，可有效地发挥各组分的去污作用，只有LAS不利于酶的稳定性，但是如果LAS与其他组分分别按照同等比例混合的话，可显著减少LAS对酶活的负面影响，这说明表面活性剂之间适当复配可有效地增强液体酶的稳定性。不过需要注意的是在含有多酶复合的洗涤剂中，其中的酶不仅能够对污渍进行降解，而且也会对洗涤剂配方体系中其他酶进行降解。所以，既要解决酶与表面活性剂等其它组分的共存问题，也需要解决酶与酶之间的共存问题。Fang等[25]发明了一种稳定液体复合酶洗涤剂中脂肪酶和蛋白酶的方法，通过一定的方法制备囊泡包裹的蛋白酶溶液和囊泡包裹的脂肪酶溶液，使其混合形成囊泡浓缩液，得到的酶泡浓缩液直接用于洗衣液中，其脂肪酶不会被蛋白酶降解，而且囊泡中的酶还能抵抗表面活性剂的抑制。在液体洗涤剂中，为了降低蛋白酶对淀粉酶活性的影响，往组分体系中加入一定比例的4-甲酰苯基硼酸来抑制蛋白酶的活性，而在经水稀释后的实际洗涤浓度下蛋白酶的活性并不会受到抑制，即不会影响蛋白酶去污功效的发挥，从而提高了两种酶的协同去污效率[26]。

对于酶制剂的应用，国内市场与国外发达市场最大的差距就在于复合酶的使用，国内目前绝大部分洗涤产品只使用了单一酶[27]，很少使用复合酶，在这方面国内对于复合酶制剂的研究与开发仍需要很多的工作要做。

3 展望

在液体洗涤剂中，保持酶的稳定性重点在于解决表面活性剂与酶的配伍问题。鉴于表面活性剂与酶的使用种类不同，所以需要研究说明哪种表面活性剂最有利于酶的稳定性以此作为指导原则。作为一般性规则，非离子表面活性剂一般情况下比离子型表面活性剂对酶更有利，这种差异主要归因于表面活性剂与酶的绑定模式的不同，非离子表面活性剂只能通过疏水相互作用与酶结合，而离子型表面活性剂可以通过静电吸引和疏水相互作用结合。为了能够更好地提高液体酶稳定性，除了研究表面活性剂与酶的配伍之外，人们往往还会关注稳定剂及其多组分的最优配伍方面，这对于酶制剂的工业应用起到了至关重要的作用。而且，随着绿色环保的要求逐渐提高，在未来开发与酶更适配的绿色表面活性剂、稳定剂等洗涤剂成分将会成为重要的研究方向；同时，从配方与生产工艺的角度来分析，对含酶洗涤剂进行浓缩化工艺升级来提高酶稳定性会越来越得到重视。