响应曲面法优化提取柴胡总皂苷的工艺

姬海刚，杨秀芳，2，惠昱昱，郭林新

(1.陕西科技大学 化学与化工学院，陕西 西安 710021；2.陕西科技大学 陕西省轻化工助剂重点实验室，陕西 西安 710021)

柴胡为伞科植物柴胡(BupleuremChinenseDC.)或狭叶柴胡(BupleuremscorzonerifoliumWilld)的干燥根，是常用的传统中药[1-3]，东北和陕西等地是柴胡的主要产区[4]。柴胡具有疏散退热和疏肝解郁等功效[5]，临床上用于感冒发热症状[6]。皂苷是柴胡中的主要生物活性成分之一。但是目前对秦岭太白山区柴胡皂苷的提取报道很少。本文采用乙醇加热回流提取法通过Design-Expert软件设计响应曲面提取柴胡总皂苷[7],为合理开发该地区柴胡的药用价值提供参考。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

柴胡，采自陕西太白山区，经西北农林科技大学林学院康永祥教授鉴定为柴胡 (BupleurumChinenseDC.)；香草醛，高纯级；柴胡皂苷a，色谱纯；乙醇、甲醇、冰乙酸、高氯酸等均为分析纯。

723N可见分光光度计；Cary 5000 紫外-可见-近红外分光光度计；DFY-200C高速万能粉碎机；DZKW-D-4 电热恒温水浴锅；RE-52A旋转蒸发器。

1.2 实验方法

柴胡粉碎过40目筛。称取适量的柴胡粉末，置于圆底烧瓶，加入浓度70%的乙醇溶液，料液比 1∶20 g/mL，加热回流，提取3 h。趁热过滤，收集滤液，减压回收乙醇，得浸膏。测定柴胡皂苷含量，计算柴胡总皂苷的得率(%)。

柴胡总皂苷得率=(提取液中柴胡皂苷含量×供试品溶液体积)/柴胡质量×100%

1.3 分析方法

1.3.1 供试品溶液的制备 定量称取浸膏，用甲醇定容于50 mL的容量瓶，4 ℃保存备用。

1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取柴胡皂苷a标准品2.4 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中。

1.3.3 检测波长的确定 精密移取对照品溶液200 μL，以甲醇为空白对照，水浴挥干溶剂，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液200 μL，高氯酸800 μL，在60 ℃水浴中放置15 min。取出，用流动水冷却至室温，加入冰醋酸5.0 mL，摇匀[8]。在400～800 nm处进行紫外扫描，结果见图1。

图1 柴胡总皂苷在不同波长下的扫描光谱图Fig.1 Scanning spectra of total saikosaponins of BupleurumChinense DC at different wavelengths

由图1可知，最大吸收波长在610 nm，与钟巧妮等[9]报道的结果基本一致。

1.3.4 标准曲线的绘制 分别精密移取柴胡皂苷对照品a溶液0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mL，挥干溶剂，按1.2.3节的显色方法操作，在波长610 nm处用可见分光光度计测定溶液的吸光度，以溶液的浓度(C)作为横坐标，吸光度(A)作为纵坐标，作图，得线性回归方程A=29.667C+0.086 8，R2=0.999 1，线性关系良好。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂对柴胡总皂苷得率的影响

不同的提取溶剂对植物不同成分的提取影响较大，提取溶剂与目标成分极性相似时，则容易提取目标成分[10]。本文从绿色环保的角度考虑，选择常用的溶剂乙醇与水作为提取溶剂。乙醇浓度40%，料液比1∶20 mg/L，提取时间60 min，提取温度 60 ℃，结果见图2。

图2 提取溶剂对总皂苷得率的影响Fig.2 Effect of extraction solvent on the yield of total saponins

由图2可知，用乙醇提取的得率明显高于水提得率。所以，选择乙醇作为提取溶剂。

2.2 乙醇浓度对柴胡总皂苷得率的影响

料液比1∶20 mg/L，提取时间60 min，提取温度60 ℃，乙醇浓度的影响见图3。

图3 乙醇浓度对总皂苷得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of total saponins

由图3可知，当乙醇浓度升高时，柴胡总皂苷的得率增加，但当乙醇浓度超过70%以后，总皂苷得率开始下降。这是因为由于乙醇浓度的增加，醇溶性杂质和色素等成分溶出以及溶液极性的变化导致总皂苷得率下降[11]。因此，选择70%。

2.3 料液比对柴胡总皂苷得率的影响

乙醇浓度70%，提取时间60 min，提取温度 60 ℃，料液比的影响，结果见图4。

图4 料液比对柴胡总皂苷得率的影响Fig.4 Effect of material/liquid ratio on yield of total saponins

由图4可知，随着料液比的增加，柴胡总皂苷的得率上升，当料液比<1∶20 g/mL时，上升的趋势较快，说明在此料液比的范围内，增大溶剂的量对总皂苷的得率提升较大。但当料液比>1∶20 g/mL时，继续增加溶剂的量对总皂苷得率的提升较小。因此，选择料液比1∶20 g/mL。

2.4 提取时间对柴胡总皂苷得率的影响

乙醇浓度70%，料液比1∶20 g/mL，提取温度60 ℃，提取时间的影响见图5。

由图5可知，延长提取时间，总皂苷得率先增加后降低。总皂苷得率在150 min达到最大值。原因可能是在提取的初始阶段，随着提取时间的增加，有利于皂苷和其它极性化合物的溶解。然而，随着时间的延长，由于长期处于温度较高的环境，柴胡总皂苷部分分解[12]。因此，选择150 min。

图5 提取时间对柴胡总皂苷得率的影响Fig.5 Effect of extraction time on yield of total saponins

2.5 提取温度对柴胡总皂苷得率的影响

乙醇浓度70%，料液比1∶20 g/mL，提取时间150 min，考察提取温度对柴胡总皂苷得率的影响，结果见图6。

图6 提取温度对柴胡总皂苷得率的影响Fig.6 Effect of extraction temperature on yield of total saponins

由图6可知，提取温度增加，总皂苷得率先增大后减小，提取温度60 ℃时,总皂苷得率最高。因为随着温度的升高，溶剂分子运动加快，促进溶剂分子更快进入柴胡细胞内。所以在60 ℃之前，随着温度的升高，溶剂分子运动加快，柴胡总皂苷的得率增加。但当温度超过60 ℃时，部分柴胡皂苷在较高温度下分解，总皂苷得率下降[13]。因此，选择60 ℃。

2.6 响应曲面法优化柴胡总皂苷的提取条件

在单因素实验的基础上，通过Box-Behnken进行实验设计，采用Design-Expert软件对乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度进行优化，因素与水平见表1，结果见表2。

表1 响应曲面的因素水平表Table 1 Factor level table of design response surface

表2 响应面法实验结果Table 2 Results of response surface experiment

2.6.1 建立回归方程 上述实验结果通过Design-Expert软件进行分析，得回归方程Y=3.01-0.11A-0.071B-0.027C+0.1D-0.11AB-0.18AC+0.28AD+2.500E-003BC-0.063BD-0.047CD-0.31A2-0.38B2-0.32C2-0.56D2，方差分析结果见表3。

表3 实验结果分析[14]Table 3 Analysis of experimental results

由表3可知，回归方程的F值为 33.59，平方和为 3.74，自由度为14，均方为0.27，其显著水平P<0.01，说明该模型非常显著。

由表3还可知，A、AD、A2、B2、C2、D2对柴胡总皂苷得率的影响较大，达到极显著水平(P<0.01)，B、D、AB、AC达到显著水平(P<0.05)，因素C(P=0.313 3>0.05)不显著。

2.6.2 响应曲面分析 将提取时间、提取温度、乙醇浓度、料液比中任意两个因素设为定值时，分析另外两个因素间的交互作用及对总皂苷得率的影响[15]，结果见图7。

图7 各因素交互作用的响应曲面图Fig.7 Response surface of interaction of various factors

2.6.3 工艺条件优化 通过优化得到的工艺参数：乙醇浓度68.6%，温度60.58 ℃，提取时间 149.78 min，料液比1∶19.61 g/mL，总皂苷得率3.02%。为简化工业化的操作，将工艺参数调整为：乙醇浓度69%，温度61 ℃，提取时间150 min，料液比1∶20 g/mL，并在该条件下进行验证实验，重复3次，总皂苷平均得率3.12%，理论值与预测值相差0.1%。说明该工艺参数可靠。

3 结论

用乙醇提取柴胡总皂苷的最佳工艺参数为：乙醇浓度69%，提取温度61 ℃，提取时间150 min，提取料液比1∶20 g/mL。在该条件下，柴胡总皂苷的提取率3.12%。