一种甜菊糖转化产物分析检测方法的建立

皇甫瑞娟 姜雪(宁夏工商职业技术学院 能源化工学院，宁夏 银川 750021)

0 引言

糖在我们的日常生活中起着重要的作用，不管是作为能量来源之一还是作为食品甜味剂，都是我们生活所离不开的。当前可供人们食用的甜味剂很多，如甜度最高的蔗糖，适用于糖尿病人服用的木糖醇，另外还有果糖、乳糖、山梨醇等多种甜味剂。

甜菊糖是一种从甜味菊茎叶中提取的天然甜味剂[1]，是几种甜菊苷混合物，其化学通式为(C5H8)4。我国早在1980年左右就获得了甜菊糖苷，即“甜菊糖”。经大量药物实验证明，甜菊糖无毒副作用，无致癌物，食用安全，经常食用可预防高血压、糖尿病、肥胖症、心脏病、龋齿等病症，是一种可替代蔗糖非常理想的甜味剂[2]。但美中不足的是甜菊糖有着严重的苦涩后味，与蔗糖优良的口感不能相比，从而至今尚未被市场消费者所接受。因此，努力改进甜菊糖苷的苦涩后味是目前研究的热点问题之一。

甜菊糖是白色至微黄色结晶性粉。熔点198℃。1g该品可溶于800ml水，微溶于乙醇。比旋光率[α]20/D 为-39.3°(C=5.7，H2O)。在空气中迅速汲湿。耐高温，在酸性及碱性溶液中比较稳定[2]。近些年对甜菊糖研究报道较多，对其成分分析检测方法各异，其中高效液相(HPLC)色谱法因分离效率高、检测灵敏度高和分析速度快的优点，应用较为广泛。但由于检测条件各不相同，其检测效果也各有差异。本文通过实验，建立了高效液相色谱(HPLC)对甜菊糖转化产物的检测方法，为进一步研究提供了基础。

1 材料与仪器

1.1 色谱仪的选择

高效液相色谱仪因为分析速度快，分离效率高，在较短分析时间内可以获得很高的柱效和较高的分离能力。对沸点高、分子量大、受热易分解的有机物、生物活性物质以及多种天然产物，分离较好，检测灵敏度也较高，因此应用范围十分广泛。通常，高效液相色谱仪是由高压输液系统、进样器、色谱柱、检测器、色谱工作站等几部分组成。在测定样品对紫外或者可见光的吸收程度时，通常用到紫外可见光吸收检测器以及光二极管阵列检测器(PAD)两种。用UV-VIS检测器检测的化合物应有相应的吸收基团，并且要知道这个吸收基团的最大吸收波长是多少。因为只有在吸收基团的最大吸收波长附近检测才可以得到高灵敏度和宽线性范围。PAD检测器的优点是可以获得样品组分的光谱信息，可以定性判定或鉴定不同类型的化合物，同时对未分离组分可以判断其中的纯度情况；同时，该检测器的波长无需事先设定，根据各个组分的吸收峰的波长选择最佳值后进行定量分析。PAD类检测器尽管具有较高的灵敏度，但是与单波长吸收检测方法相比，其灵敏度和线性范围均不如单色光高。主要是单波长检测器所用的光敏元件检测效率高，如果采用光电倍增管放大效率更为显著；同时，多波长吸收与单波长吸收所得到的结果也有差别。因此，目前的检测器灵敏度可调波长检测器比二极管阵列高约一个数量级左右。在低浓度样品分析时，采用单波长检测器获得的定量结果更加准确。本实验所用的HPLC为Waters 2695 系统，软件为Empower。该仪器由Waters 2695分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机等部分组成。

1.2 色谱柱的选择

色谱是一种分离分析手段，因此，色谱柱是高效液相色谱仪的核心部件。柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。目前市售的高效液相色谱分离柱的内径有4.6mm和3.9mm两种规格，柱长一般用100～300mm就能满足复杂混合物的分析要求。本实验用HPLC来分析甜菊糖转化产物的情况，故属于分离糖类物质[3]，同时应用反相液相色谱的分离方法，选用了一根Waters Sunfire C18(4.6×150mm 5μm)柱，该柱填料为球形硅胶键合C18并采用了新型的键合和端基封尾技术，能够提供完美的色谱峰型。

2 色谱条件的确立

在进行正式的实验之前，首先需要确立色谱检测条件，主要是对流动相流速、流动相配比、色谱柱长度、色谱柱温度等因素进行优化，以便得到最好的检测效果。对于Waters2695来说，开机之前首先需要对样品和流动相进行过滤(通常过0.22μm滤膜)，过滤完毕再超声脱气10min左右。更换四元泵流动相，通常A为甲醇、B为乙腈、C为水、D为缓冲盐。

整个实验过程结束后，要冲洗系统、色谱柱。冲洗原则：C18柱先用水(90%左右，具体需根据色谱柱要求)冲洗水溶性物质，逐渐增加有机相比例，最终色谱柱保存于100%乙腈(或其它有机相)。关闭软件和电脑，设流速为“0”，关脱气机，关闭主机和检测器的电源。

2.1 第一次预实验

第一次预实验选择了以下参数，如表1所示。

在上述条件下检测出的色谱图，如图1所示。

结果分析：由以上色谱图可以看出，两主要组分未分开，预计是有机相比例较高，洗脱能力较强，出峰快所导致。下一步将降低有机相比例。

表1 第一次预实验参数

图1 第一次预实验结果检测色谱图

2.2 第二次预实验

第二次预实验，在其他条件不变的情况下将乙腈和水的比例降低，使乙腈:水＝30:70，这次检测出的色谱图，如图2所示。

结果分析：从这次的结果中可以看出，改变有机相比例使得两主要组分的分离效果有所改善，但还是没有完全分开，这是我们所不愿意看到的。但是继续降低有机相比例将会导致出峰过慢、检测时间长，故下一步计划增加柱长，以增强分离效果。

2.3 第三次预实验

在第三次预实验中，使用了一根SunFire TM C18 5μm，4.6×250mm柱子，比原来的柱长多了100mm，理论上结果会好一些，这次检测的色谱图，如图3所示。

通过这次的结果可以看出，主要组分的峰基本分开，结果比较理想。至此检测条件初步确立。在后续的实验过程中，都将使用以下的条件做检测，如表2所示。

3 结语

甜菊糖可广泛用于食品、饮料、医药、日用化工、酿酒、化妆品等行业，并且较应用蔗糖可节省成本70%。甜菊糖色泽纯白，口感适宜，无异味，是发展前景广阔的新糖源。甜菊糖是目前世界已发现并经我国卫生部、轻工业部批准使用的最接近蔗糖口味的天然低热值甜味剂。是继甘蔗甜菜糖之外第3种有开发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被国际上誉为“世界第三蔗糖”。本文采用实验方法确立了HPLC法测定甜菊糖转化产物分析方法的最优色谱条件。为后续酶法对甜菊糖改性实验奠定了基础。

图2 第二次预实验结果检测色谱图

图3 第三次预实验结果检测色谱图

表2 甜菊糖转化产物色谱条件