响应面法优化高效液相色谱分析蜂蜜中5种生物胺的衍生条件

梁梦洁,黄丽佳,刘 欣,李 晶,宋春满,张建铎,*

(1.云南中烟工业有限责任公司技术中心,云南昆明 650106;2.昆明医科大学,云南昆明 650500)

生物胺是一类主要由氨基酸脱羧或醛和酮氨基化形成的弱碱性低分子量含氮化合物,常存在于动植物和微生物体内,食品在发酵或腐烂过程中也会产生生物胺[1]。发酵乳制品、酒类、水产品、肉类产品、调味液等富含蛋白质和氨基酸的食品广泛存在生物胺[2]。微量的生物胺是生命体内生成荷尔蒙、核酸、蛋白质等的前体物质,在生物细胞中具有重要的生理功能,但摄入过量含有生物胺的食品,会引起中毒,甚至危及性命[3-4]。

蜂蜜是人们喜爱的一种保健食品,含有少量蛋白质和多种游离氨基酸[5],并含多种适宜微生物生长繁殖的营养物质,在酸性环境下易生成生物胺。蜂蜜在加工和储存过程中均有可能被微生物侵染而产生生物胺。目前有关蜂蜜中生物胺种类和检测方法鲜有报道,仅见赵玲玲等[6]利用超高效液相色谱-串联质谱检测了蜂蜜中8种生物胺含量,而高效液相色谱分析蜂蜜中生物胺含量未见报道。因此有必要建立简便的高效液相色谱分析蜂蜜中生物胺的方法。

目前,分析生物胺的常用方法主要有离子色谱法[7]、毛细管电泳法[8]、高效液相色谱法[9]、高效液相色谱-串联质谱法[10]、超临界流体色谱-串联质谱法[11]等。其中高效液相色谱法因对仪器配置要求不高而广为应用,但液相色谱法需要将样品衍生化处理后才能检测。衍生化处理分为柱前衍生和柱后衍生两种。柱后衍生法需要专用的衍生设备,因此柱前衍生-高效液相色谱法分析生物胺应用更广。柱前衍生法主要有FITC衍生法、OPA衍生法,苯甲酰氯衍生法和丹磺酰氯衍生[12-13],其中丹磺酰氯衍生因简便稳定被广为应用[14-15]。影响丹磺酰氯衍生反应的主要因素有衍生体系pH、衍生时间和衍生温度。不同文献的衍生条件各不相同,也有文献对衍生条件进行了单因素优化[16]或正交设计优化[17],但这些实验设计未能考虑因子的交互作用。为了确定丹磺酰氯衍生法测定蜂蜜中生物胺含量的最佳衍生条件,本实验采用响应面设计方法,对衍生体系pH、衍生温度和时间进行了优化,便于蜂蜜中生物胺含量的准确测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乙腈 色谱纯，美国Fisher公司;丹磺酰氯 美国Sigma-Aldrich公司，纯度99.5%;标准品色胺、酪胺、组胺、尸胺、腐胺、精胺、亚精胺 纯度均大于99.0%,美国Sigma-Aldrich公司;HCl、HClO4、NaOH、NaHCO3、氨水 均为分析纯,西陇化工有限公司;冠生园蜂蜜(油菜蜂蜜、杨槐蜂蜜和荆条蜂蜜的混合蜜) 上海冠生园蜂制品有限公司。

Agilent 1200高效液相色谱仪(配备G1312B二元泵,G1367D自动进样器、G1316B柱温箱和G1315C二极管阵列检测器) 美国Agilent公司;Agilent 7696样品处理工作台(配备自动衍生功能模块) 美国Agilent公司;Biofuge Stratos离心机 美国Thermo公司;Sartorius PB-10酸度计 德国Sartorius公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制 混合标准溶液:分别准确称取腐胺、精胺、尸胺、亚精胺和组胺标准品100 mg于100 mL容量瓶中,用0.1 mol/L盐酸溶解定容,配成1.0 mg/mL的单一标准储备液。根据实验需要,分别移取不同体积的标准储备液于容量瓶中,用0.4 mol/L HClO4稀释成不同浓度的系列标准溶液。

1.2.2 样品提取 称取0.5 g蜂蜜至5 mL离心管中,精确至0.01 g,加入2 mL 0.4 mol/L HClO4超声提取45 min,8000 r/min离心10 min,取上清液衍生。

1.2.3 样品衍生 衍生方法参考文献[18],略作改动。移取1 mL样品提取液和1 mL 20 μg/mL混合标准液于离心管中,加入2 mol/L NaOH溶液200 μL、饱和NaHCO3溶液300 μL、4 mg/mL丹磺酰氯溶液1 mL,涡旋混匀后密封,45 ℃避光衍生40 min,加入100 μL浓氨水,涡旋1 min,静置30 min用乙腈定容至5 mL,涡旋混匀,8000 r/min离心5 min,上清液经0.45 μm有机滤膜过滤后上机分析。

1.2.4 分析条件 液相色谱柱:Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱(100 mm×3 mm,2.7 μm);流动相:A为0.1%乙酸铵水溶液,B为乙腈;洗脱程序:0～5 min,50%～5% A;5～7 min,5% A;7～7.5 min,5%～50% A;7.5～9 min,50% A;流速:0.5 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:5 μL。检测波长:345 nm。

1.2.5 单因素实验 不同研究者采用丹磺酰氯衍生生物胺时,使用的衍生条件差异较大,衍生体系pH在9.5～12[19-20],衍生温度在30～70 ℃[21-23],衍生时间在15～60 min[24-26]。本实验参考多数文献,设计衍生体系pH、衍生温度和衍生时间的不同水平进行单因素实验,考察各因素对生物胺衍生物峰面积响应的影响。

1.2.5.1 衍生体系pH对峰面积响应的影响 设计衍生体系pH9.5、10、10.5、11、11.5和12六个水平进行单因素实验,固定衍生温度45 ℃、衍生时间40 min,考察不同衍生体系pH对生物胺峰面积响应的影响,预选出合适pH进行优化实验。

1.2.5.2 衍生温度对峰面积响应的影响 设计衍生温度30、35、40、45、50、55 ℃六个水平进行单因素实验,固定pH11、衍生时间40 min,考察不同衍生温度对生物胺峰面积响应的影响,预选出合适的衍生温度进行优化实验。

1.2.5.3 衍生时间对峰面积响应的影响 设计衍生时间30、35、40、45、50、55 min六个水平进行单因素实验,固定pH11、衍生温度45 ℃,预选出合适的衍生温度进行优化实验。

1.2.6 响应面试验 以衍生体系pH(A)、衍生温度(B)、衍生时间(C)为响应因子,以各种生物胺峰面积(Y)为响应值,进行Box-Behnken响应面优化设计。以获取生物胺衍生反应的最优条件。根据单因素实验结果,pH范围设为10～12,衍生温度设为30～60 ℃,衍生时间设为30～50 min。实验因素与水平设计见表1。

表1 响应面设计的因素与水平

1.3 数据处理

采用Design-Expert(Ver.11)软件处理数据,每个处理平行重复3次,取平均值计算分析,绘制响应面图,计算拟合方程和各因素的最优值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 pH对衍生效果的影响 pH在9.5～12范围内,5种生物胺的峰面积响应均呈先升后降的趋势,但5种生物胺稍有差别。腐胺、尸胺和组胺在pH11时峰面积响应最大,然后随pH升高逐渐降低;精胺和亚精胺在pH10.5时峰面积响应最大,然后随pH升高而逐渐降低(图1)。

图1 pH对生物胺衍生物峰面积响应的影响

2.1.2 衍生温度对衍生效果的影响 在衍生温度30～55 ℃范围内,5种生物胺的峰面积响应均为先随温度升高而增加,而后逐渐降低。腐胺和组胺在45 ℃达到峰面积最大值,精胺、亚精胺和尸胺在40 ℃达到最大值,而后逐渐降低。这是因为温度升度能够加速衍生化反应,但过高的温度可能破坏衍生物的稳定性(图2)。

2.1.3 衍生时间对衍生效果的影响 在衍生时间30～55 min范围内,5种生物胺的峰面积响应均为先随衍生时间延长而增加,而后逐渐降低。腐胺和组胺在40 min达到峰面积最大值,精胺、亚精胺和尸胺在45 min达到最大值,而后逐渐降低(图3)。

2.2 回归模型建立与参数检验

响应面设计的各实验对应的衍生样品经高效液相色谱检测,5种生物胺的峰面见如表2,通过Design-Expert软件分析实验数据,可得到各因素水平与生物胺峰面积的拟合方程如下。

腐胺:Y=1590.26-157.02A+ 36.15B+ 40.24C-19.91AB+ 175.73AC-40.11BC-877.94A2-437.08B2-227.08C2

精胺:Y=1134.28-236.08A+31.00B-22.44C-13.86AB+38.76AC-17.50BC-693.33A2-208.47B2-194.66C2

亚精胺:Y=1600.48-282.48A-34.98B-5.08C+25.29AB+147.14AC-54.09BC-706.51A2-576.16B2-446.56C2

尸胺:Y=1344.39-57.58A-17.36B+55.90C+3.73AB+272.78AC+26.09BC-884.35A2-257.20B2-62.98C2

组胺:Y=707.47-169.85A-55.23B+48.23C+32.13AB-19.36AC+112.47BC-345.59A2-159.26B2-141.38C2

5种生物胺拟合模型的方差分析与参数显著性检验结果如表3～表7,5个拟合模型P<0.0001,表明5个模型均有效,具有统计学意义。

腐胺、精胺、亚精胺、尸胺和组胺拟合模型的校正决定系数(AdjustedR2)分别为0.9978、0.9980、0.9970、0.9989和0.9979,预测决定系数(PredictedR2)分别为0.9857、0.9755、0.9876、0.9854和0.9781。各个模型的校正R2>0.99,预测R2>0.99,表明模型拟合度高,试验误差小。方差分析结果显示,模型失拟项P>0.05,说明模型不失拟,能充分反映实际情况,能很好地进行预测。

表2 响应面设计方案与实验结果

表3 腐胺响应面拟合模型方差分析

腐胺、精胺、亚精胺、尸胺和组胺拟合模型的信噪比(Adeq Precision)分别为65.54、51.03、71.72、68.03和50.65,均大于4,说明该模型响应信号强,可进行真实值的分析和预测试验结果。变异系数分别为3.42%、4.77%、3.65%、3.29%和4.45%,均小于5%,说明模型是可重复的。

5种生物胺拟合模型的一次项中A(pH)均影响极显著(P<0.01);腐胺、尸胺、组胺拟合模型的一次项B(衍生温度)影响极显著(P<0.01);组胺拟合模型的一次项C(衍生时间)影响极显著(P<0.01)。除精胺拟合模型外,其余模型一次项C均影响显著(P<0.05)。5种生物胺拟合模型的二次项均影响极显著(P<0.01)。腐胺、尸胺、亚精胺拟合模型的交互项AC影响极显著(P<0.01),精胺和组胺拟合模型的交互项AC影响显著(P<0.05),各交互项对生物胺拟合模型的影响见图4,其余交互项均无显著影响。根据方差分析的F值(P值)可知,3个衍生因素对生物胺响应的影响大小依次为pH>衍生温度>衍生时间。

表4 精胺响应面拟合模型方差分析

表5 亚精胺响应面拟合模型方差分析

表6 尸胺响应面拟合模型方差分析

表7 组胺响应面拟合模型方差分析

表8 生物胺响应面拟合模型验证结果

图4 pH和衍生时间交互作用对生物胺峰面积影响的响应面图

2.3 最佳条件的确定和回归模型的验证

根据响应面拟合方程进行参数最优分析,得到5种生物胺最优衍生条件如下:腐胺:pH10.92、衍生温度45.79 ℃、衍生时间40.41 min;精胺:pH10.82、衍生温度43.91 ℃、衍生时间40.77 min;亚精胺:pH10.77、衍生温度43.85 ℃、衍生时间40.48 min;尸胺:pH11.05、衍生温度43.26 ℃、衍生时间39.95 min;组胺:pH10.83、衍生温度46.71 ℃、衍生时间38.57 min。为方便统一操作,生物胺最优衍生条件设为pH11、衍生温度45 ℃、衍生时间40 min。

在此条件下进行2个浓度(10、20 μg/mL)的3组平行实验,腐胺、精胺、尸胺、亚精胺和组胺5种生物胺的实际峰面积响应与模型预测值的相对误差数值介于2.32%～4.94%,均小于5%,说明模型能较好地预测生物胺的衍生效果,具有实际意义。

3 结论

本实验在单因素优化基础上,采用响应面设计方法建立了5种生物胺衍生化条件的响应面模型,模型拟合度高,预测值与实际值吻合好。根据模型参数的统计检验,各因素对衍生效果影响大小依次为pH、衍生温度、衍生时间。最优衍生条件为pH11、衍生温度45 ℃、衍生时间40 min。在此条件下进行验证实验,腐胺、精胺、尸胺、亚精胺和组胺5种生物胺的实际峰面积响应与模型预测值的相对误差数值介于2.32%～4.94%,均小于5%,说明模型能较好地预测生物胺的衍生效果。本实验优化得到的最优衍生条件对于高效液相色谱分析蜂蜜中的生物胺有实用价值。