辐照红景天乙醇提取物的抗氧化作用及美白作用研究

孙熙浛,齐 欣,崔承弼,*

(1.延边大学农学院,吉林延吉 133002;2.延边大学药学院,吉林延吉 133002)

高山红景天为红景天属景天科植物,其根在西伯利亚和亚洲的传统医学体系中扮演重要角色。红景天生长在高海拔和强紫外线照射的区域,由于其长期适应缺氧、大风、干燥、高寒等恶劣的自然生态环境,故具有吸收水分和保湿的功能。紫外线或强光刺激皮肤,会引起深褐色的色素沉着和斑点。这些色素沉着的形成主要是由酪氨酸激酶催化多巴等物质的产生所引起。红景天可抑制酪氨酸激酶活性[1],从而防止黑色素沉着和暗褐色斑点的形成。经常暴露在紫外线下的皮肤和眼睛,是自由基最活跃的地方,自由基会侵犯皮肤组织,加速其老化。红景天具有抗氧化性[2],能够抵御自由基损坏,延缓衰老过程。除此之外,红景天还具有降血脂[2]、抗疲劳[3]、抗抑郁[4]、抗炎[5]、抗衰老[6]、耐缺氧[7]、调节免疫力[8]、肝保护[9]、抑制肿瘤转移[10]等功效。研究证明,红景天能提高工作效率和抗应激能力,可预防氧化应激引发的相关疾病[11],还可治疗代谢紊乱[12]和不稳定型心绞痛[13],并具有治疗糖尿病的药理特性[14]。红景天在抗焦虑、压力和认知方面的积极作用也有报道[15-16],但尚无辐照处理红景天提取物的抗氧化及美白作用方面的研究。

辐照食品是采用放射性60Co的γ射线、X射线或高能电子束等穿过食物机体,使其中的水分和各种营养物质发生电离作用后,破坏细胞内的DNA分子,消灭并除去食物中的微生物、害虫等,以使食物表面及内部发生生物、化学性的改变[17]。CAC指出允许根据所需目标用高于10 kGy的辐照剂量对样品进行处理,并强调了10 kGy以上的辐照也是安全的[18]。齐仕博等[19]发现一定剂量的辐照能提升参制品中人参皂苷的活性。在前期试验基础上,发现辐照处理能提高红景天的活性成分,所以对辐照处理红景天进一步研究。

本试验所用红景天于四川省原子能研究院进行60Co-γ射线进行辐照处理,辐照剂量分别设置为5、10、20、30 kGy,通过70%乙醇提取其活性成分进行DPPH自由基清除实验、ABTS自由基清除实验、铁离子还原能力(FRAP)实验、酪氨酸酶抑制实验及小鼠B16黑色素瘤细胞实验,研究5、10、20、30 kGy60Co-γ射线辐照红景天和未辐照红景天提取物的抗氧化作用及美白作用,为辐照红景天乙醇提取物在抗氧化作用及美白作用上的研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

高山红景天 由长白山科学研究院提供并于四川省原子能研究院进行辐照处理;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 英骏生物技术有限公司;2,4,6-三(2-吡啶)-1,3,5-三嗪(TPTZ) 比利时Acros organics公司;2,2′-联氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS) 美国Fluka公司;维生素C(VC) 北京化学试剂公司;3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT) 上海江莱生物科技有限公司;L-酪氨酸(L-tyrosine,Tyr) Sigma试剂公司产;酪氨酸酶(EC 1. 14. 18. 1,tyrosinase,TYR) 诺维信(中国)生物技术有限公司;PBS pH=7.4,Gibco公司,10010023,500 mL;B16(小鼠黑色素瘤细胞) 中国科学院上海细胞库。

60Co-γ辐照源 四川省原子能研究院;MCO-5AC CO2培养箱 日本三洋公司;DTC-22B真空泵 日本ULUAC KIKO公司;LyoQuest-85实验型冷冻干燥机 西班牙Telstar集团;紫外可见分光光度计 上海谱元仪器有限公司;电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;96孔板 BIOFIL公司;FE20t型pH计 Mettler Toledo公司;1510全波长Multiskan GO酶标仪 Thermo Fisher公司;XH-B型旋涡混合器 江苏天翎仪器有限公司;TG16-II型离心机 湖南凯达科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 红景天材料的处理 将红景天根茎破碎,在80 ℃条件下烘干,用40目型粉碎机进行粉碎,得到红景天粉末。包装好的红景天粉末送至四川省原子能研究院进行辐照处理[20],以60Co-γ射线为辐照源,辐射距离37 cm,样品的平铺厚度3 mm,用重铬酸钾(银)剂量计进行剂量追踪,辐照剂量分别设置为5、10、20、30 kGy,未经过辐照的用0 kGy表示。每组250 g红景天,剂量率均为1 kGy/h,辐照时间分别为5、10、20、30 h,每个剂量设3次重复。处理后的红景天置于冰箱冷藏室内4 ℃贮存备用。在前期的预试验中发现原料和提取物经辐照处理后对红景天而言没有差异,因此选择原料辐照后进行本试验。

1.2.2 红景天提取物的制备 用质量分数为70%的乙醇按照料液比1∶10在80 ℃水浴中提取1 h,以3000 r/min离心20 min后收集上清液。根据上述条件提取沉淀物,共进行三次提取,并蒸发浓缩收集的上清液,冷冻干燥,将最终提取物粉末密封并储存以用于随后的实验。

1.2.3 辐照对红景天提取物抗氧化能力的影响

1.2.3.1 清除DPPH自由基能力检测 参照文献[21],称量不同辐照剂量红景天提取物0.05 g,溶于适量无水乙醇中,定容至50 mL容量瓶,得样品溶液1 mg/mL,分别将其稀释得0.500、0.100、0.020、0.010、0.005、0.002、0.001 mg/mL的样品溶液,总反应体系为3.0 mL。不同辐照剂量红景天提取物清除DPPH自由基反应体系示于表1。

表1 不同辐照剂量红景天提取物清除DPPH自由基反应体系

按照表1所示试剂的顺序依次添加到试管中,摇匀,避光静置30 min,以4000 r/min离心10 min,取上清液,在517 nm处分别测定吸光度Ai、A0、Aj。以标准VC为阳性对照。

分析所得数据,并根据式(1)求得样品对DPPH自由基的清除率。

式(1)

1.2.3.2 清除ABTS自由基能力检测 参照文献[22],称量不同辐照剂量红景天提取物0.05 g,溶于适量无水乙醇中,定容至50 mL容量瓶,得样品溶液1 mg/mL,将其稀释得0.50、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05 mg/mL的样品溶液。总反应体系为5.1 mL。不同辐照剂量红景天提取物清除ABTS自由基反应体系示于表2。

按照表2所示试剂的顺序依次添加到试管中,摇匀,静置6 min,在734 nm处分别测定吸光度Ai、A0、Aj。以标准VC为阳性对照。

分析所得数据,并根据式(2)求得样品对ABTS自由基的清除率。

式(2)

1.2.3.3 铁离子还原法 参照文献[23],称量不同辐照剂量红景天提取物0.25 g,溶于适量无水乙醇中,定容至50 mL容量瓶,得样品溶液5 mg/mL,将其稀释得3.0、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL的样品溶液。

以硫酸亚铁(FeSO4)为标准,分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2 mmol/L的FeSO4标准液,加入2.4 mL FRAP工作液,在37 ℃水浴中混匀10 min,于593 nm处测定其吸光度,用超纯水调零,绘制标准曲线,测定其抗氧化性(FRAP值)。

样品的测定:依次加入0.1 mL不同浓度的样品溶液,加入2.4 mL FRAP工作液,在37 ℃水浴中混匀10 min,于593 nm处测定其吸光度,用超纯水调零。以标准VC为阳性对照。FRAP活性计算为FeSO4当量,即硫酸亚铁/红景天提取物的浓度,其产生的吸光度值等于1 mmol/L FeSO4的吸光度值。

1.2.4 酪氨酸酶抑制实验 参照文献[24],称量不同辐照剂量红景天提取物0.05 g,溶于适量无水乙醇中,定容至50 mL容量瓶,得样品溶液1 mg/mL,将其稀释得0.50、0.40、0.30、0.20、0.10、0.05 mg/mL的样品溶液。总反应体系为1.4 mL。不同辐照剂量红景天提取物抑制酪氨酸酶反应体系示于表3。

按照表3所示试剂的顺序依次添加到试管中,摇匀,置于37 ℃条件下水浴加热20 min,在475 nm处分别测定各组吸光度。以标准VC为阳性对照。

分析所得数据,并根据式(3)求得样品对酪氨酸酶的抑制率。

式(3)

式中,A为含有酪氨酸酶但不含样品的反应体系的吸光度值;B为不含酪氨酸酶且不含样品的反应体系的吸光度值;C为含有酪氨酸酶且含有样品的反应体系的吸光度值;D为不含酪氨酸酶但含有样品的反应体系的吸光度值。

1.2.5 小鼠B16黑色素瘤细胞实验

1.2.5.1 黑色素合成抑制率测定 称量不同辐照剂量红景天提取物0.05 g,溶于适量无水乙醇中,定容至50 mL容量瓶,得样品溶液1 mg/mL,将其稀释得0.10、0.07、0.05、0.03、0.01 mg/mL的样品溶液。

取对数期的B16黑色素瘤细胞,弃去培养液,用PBS清洗2次,加入培养液,调节细胞密度为2×105个/mL接种于96板,每孔加入100 μL。孵育24 h后,弃上清液并加入样品溶液,设置对照组(细胞+培养基)。样品作用48 h后,吸去培养液用0.25%胰酶消化,以1000 r/min离心5 min,弃上清液,每个因素处理下的细胞加入500 μL含10%二甲基亚砜(DMSO)的NaOH(1 mol/L)溶液,振荡5 min后,分别测量490 nm和570 nm处各孔吸光度值。

分析所得数据,并根据式(4)求得样品对黑色素合成的抑制率。

式(4)

式中,A为样品孔在490 nm处吸光度值,B为样品孔在570 nm处吸光度值,C为对照孔在490 nm处吸光度值,D为对照孔在570 nm处吸光度值。

1.2.5.2 相对细胞活率测定(MTT法) 培养小鼠B16黑色素瘤细胞,取对数生长期的细胞,经0.25%胰蛋白酶消化,制成单细胞悬液计数,调整细胞浓度为5×104个/mL,反复吹打使细胞均匀,接种于96孔培养板中,每孔100 μL。孵育24 h后,弃去原培养液,加入不同浓度样品溶液(0.01%、0.05%、1.00%、2.00%,均为质量分数),每个浓度设置三个复孔和对照组(细胞+培养基),培养48 h后,将20 μL 5 g/L MTT溶液添加到每个孔中,继续培养4 h,吸弃孔内上清培养液,每孔加入100 μL细胞裂解液,孵育过夜后,测量570 nm处各孔吸光度值。

分析所得数据,并根据式(5)求得样品对黑色素细胞的相对细胞活力。

式(5)

式中,A为对照组平均吸光度值,B为药物组平均吸光度值。

1.3 数据处理

用SPSS 22.0软件处理,单因素方差分析,重复次数3次,取平均值。通过浓度与清除率(抑制率)的变化拟合曲线计算出样品和VC清除DPPH自由基和ABTS自由基(抑制酪氨酸酶)的IC50值。

2 结果与分析

2.1 辐照对红景天提取物抗氧化能力的影响

2.1.1 辐照对红景天提取物清除DPPH自由基效果的影响 不同辐照剂量红景天提取物对DPPH自由基的清除活性如图1所示,在浓度为1～20 μg/mL范围内,0、5、10、20、30 kGy辐照组红景天提取物清除DPPH自由基的IC50值分别为6.17、5.74、4.96、3.75、4.48 μg/mL,VC清除DPPH自由基的IC50值为3.18 μg/mL,红景天提取物浓度与DPPH自由基的清除率呈正相关。在实验浓度范围内,5、10、30 kGy辐照组红景天提取物对DPPH自由基均有一定的清除能力,但与未辐照(0 kGy)组无显著性差异(P>0.05),在浓度为5、10 μg/mL时,20 kGy辐照组红景天提取物对DPPH自由基的清除率与未辐照(0 kGy)组差异显著(P<0.05),当浓度增大到20 μg/mL时,20 kGy辐照组红景天提取物对DPPH自由基的清除率比未辐照(0 kGy)组高5.3%±0.07%,而对照组VC对DPPH自由基的清除率比未辐照(0 kGy)组高9.21%±0.04%,差异极显著(P<0.01)。不同辐照剂量红景天提取物对DPPH自由基的清除能力由大到小依次为:20 kGy>30 kGy>10 kGy>5 kGy>0 kGy。

图1 不同辐照剂量的红景天提取物和VC对DPPH自由基的清除活性

2.1.2 辐照对红景天提取物清除ABTS自由基效果的影响 在浓度为50～350 μg/mL范围内,0、5、10、20、30 kGy辐照组红景天提取物清除ABTS自由基的IC50值分别为68.70、66.27、62.57、44.88、55.60 μg/mL,VC清除ABTS自由基的IC50值为21.73 μg/mL,红景天提取物浓度与ABTS自由基的清除率呈正相关。由图2可知,在实验浓度范围内,5、10、30 kGy辐照组红景天提取物对ABTS自由基均有一定的清除能力,但与未辐照(0 kGy)组无显著性差异(P>0.05),在浓度为50、100、150 μg/mL时,20 kGy辐照组红景天提取物对ABTS自由基的清除率与未辐照(0 kGy)组差异显著(P<0.05),当浓度增大到350 μg/mL时,20 kGy辐照组红景天提取物对ABTS自由基的清除率比未辐照(0 kGy)组高2.09%±0.06%,而对照组VC对ABTS自由基的清除率比20 kGy辐照组高8.29%±0.09%。不同辐照剂量红景天提取物对ABTS自由基的清除能力由大到小依次为:20 kGy>30 kGy>10 kGy>5 kGy>0 kGy。

图2 不同辐照剂量的红景天提取物和VC对ABTS自由基的清除活性

2.1.3 铁离子还原能力的影响 FeSO4的标准曲线为y=0.4768x+0.1996,R2=0.9994,由图3可知,在红景天提取物浓度为10～200 μg/mL范围内,不同辐照剂量红景天提取物对铁离子的还原能力随着红景天提取物浓度的增加而增强,总体呈现线性关系。经不同剂量60Co-γ射线辐照处理后,不同浓度红景天提取物对铁离子的还原能力存在差异,在50～200 μg/mL范围内,5、10、30 kGy辐照组红景天提取物对铁离子的还原能力与未辐照(0 kGy)组差异不显著(P>0.05),而20 kGy辐照组红景天提取物对铁离子的还原能力显著高于未辐照(0 kGy)组(P<0.05)。当红景天提取物浓度为200 μg/mL时,20 kGy辐照组的FRAP值为(1.90±0.05) mmol/mg,而当VC浓度仅为10 μg/mL时,FRAP值为(105.15±0.05) mmol/mg,VC对铁离子的还原能力极显著高于同浓度下各辐照剂量对铁离子的还原能力(P<0.01)。不同辐照剂量红景天提取物对铁离子的还原能力由大到小依次为:20 kGy>30 kGy>10 kGy>5 kGy>0 kGy。

图3 不同辐照剂量的红景天提取物的FRAP值

2.2 辐照对红景天提取物抑制酪氨酸酶效果的影响

如图4所示,不同辐照剂量红景天提取物对酪氨酸酶均有一定的抑制作用,在浓度为50～500 μg/mL范围内,0、5、10、20、30 kGy辐照组红景天提取物抑制酪氨酸酶的IC50值分别为589.62、525.90、454.37、244.10、406.05 μg/mL,VC抑制酪氨酸酶的IC50值为99.16 μg/mL,红景天提取物浓度与酪氨酸酶的抑制率呈正相关。在浓度为100～500 μg/mL范围内,5、10、30 kGy辐照组红景天提取物对酪氨酸酶的抑制率与未辐照(0 kGy)组差异不显著(P>0.05),20 kGy辐照组红景天提取物对酪氨酸酶的抑制率与未辐照(0 kGy)组差异显著(P<0.05),而VC对酪氨酸酶的抑制率极显著高于未辐照(0 kGy)组的抑制率(P<0.01)。不同辐照剂量红景天提取物对酪氨酸酶的抑制能力由大到小依次为:20 kGy>30 kGy>10 kGy>5 kGy>0 kGy。

图4 不同辐照剂量的红景天提取物和VC对酪氨酸酶的抑制活性

2.3 辐照对红景天提取物抑制黑色素合成及黑色素细胞相对活率的影响

采用B16细胞为实验体系,观察红景天提取物作用后的黑色素合成抑制率的变化,结果见图5。当红景天浓度为100 μg/mL时,0、5、10、20、30 kGy辐照组红景天提取物对黑色素瘤细胞黑色素合成抑制率分别为35.04%±0.02%、39.06%±0.03%、38.08%±0.01%、41.12%±0.01%、40.25%±0.02%,不同辐照剂量红景天提取物的抑制能力由大到小依次为:20 kGy>30 kGy>5 kGy>10 kGy>0 kGy,表明不同辐照剂量红景天提取物均表现出明显的黑色素合成抑制能力,且呈剂量依赖关系,其中辐照剂量为20 kGy的红景天提取物的抑制效果最佳。

图5 不同辐照剂量的红景天提取物对黑色素瘤细胞合成黑色素的抑制作用

由图6可知,当红景天浓度为0.50%时,0、5、10、20、30 kGy辐照组红景天提取物对黑色素细胞的相对细胞活力分别为84.69%±0.06%、86.99%±0.08%、86.97%±0.07%、89.30%±0.07%、87.91%±0.09%,在低于0.50%的受试浓度下,各辐照组红景天提取物的细胞活力均在80%以上,且不同辐照剂量的红景天提取物在细胞活力上无显著性差异(P>0.05)。表明不同辐照剂量的红景天提取物在0.50%质量浓度下对细胞无毒副作用,实验所用浓度均在安全范围内。

图6 不同辐照剂量的红景天提取物对黑色素细胞相对活力的影响

3 讨论

氧化应激被认为是许多慢性疾病[25]的主要发病机制之一。正因如此,抗氧化行为是植物提取物中常被确定的生物活性之一[26]。在测定红景天提取物的抗氧化活性时,使用了DPPH测定法、ABTS测定法和FRAP测定法,使用3种测定方法可以提高红景天提取物抗氧化能力的总体评价,每个分析结果反映了红景天提取物抗氧化行为的不同方面,结合这些数据相比从单一分析中获得的数据可以更好地描述抗氧化活性。FRAP法与DPPH法、ABTS法分析红景天提取物的结果高度相关,具有相似的机械观点,即从抗氧化剂中转移电子以减少氧化剂[27]。但在FRAP实验中出现了两个问题,即在红景天提取物中加入FRAP工作液会出现颜色的干扰,并且颜色变化缓慢。前者可能是由于FRAP法所用的酸性pH,而DPPH法、ABTS法的问题要小得多。其他研究报告[28-30]中也提到了颜色变化缓慢的问题,并指出了多种抗氧化剂进行实验时观察到的反应,每种抗氧化剂在不同的动力学条件下起作用。红景天提取物可以显著地抑制黑色素瘤细胞合成黑色素,表明红景天提取物是一种高效的、无毒性的黑色素合成抑制剂。

近年来有许多国内外学者对红景天提取物的抗氧化及美白作用进行了大量的研究。尹秀梅等[31]用70%乙醇提取长白红景天,发现浓度为248 μg/mL时其对DPPH自由基的清除率达到90.34%。陈健[32]采用超高压提取法对红景天进行提取,当其达到最大测定浓度20 mg/mL时对DPPH自由基的清除率为63.93%±8.41%,其抗氧化活性要高于同浓度下回流、超声、微波提取法得到的红景天提取物的抗氧化活性。付晶晶等[33]研究发现,当红景天提取物浓度为400 μg/mL时,其对DPPH自由基和ABTS自由基的抑制率分别为84%和82%左右。Kosakowska等[34]通过DPPH法、ABTS法和FRAP法发现,与水提取物和干燥原料相比,红景天乙醇提取物具有较强的抗氧化能力。本试验通过DPPH法、ABTS法和FRAP法对未辐照和辐照红景天提取物的体外抗氧化活性进行研究,发现辐照剂量为20 kGy时红景天提取物的效果最好。周思思[35]采用DPPH、ABTS、FRAP三种体系检测红景天乙醇提取物的抗氧化活性,结果显示高浓度(800 μg/mL)时,红景天乙醇提取物具有较强的抗氧化能力,这与本试验结果一致。

赵进等[36]利用水提法从红景天根中提取活性成分,结果发现质量分数为0.4%的红景天提取液对自由基的清除率几乎达到了同浓度下VC溶液的水平,并且具有体外抑制酪氨酸酶活性的能力。王雪梅等[37]研究发现1 mg/mL红景天乙醇提取液对DPPH自由基的抑制率为98.5%±0.9%,浓度为10 mg/mL时其对酪氨酸酶的抑制率为85.1%±0.8%。龚静[38]研究发现红景天50%醇热浸提液浓度为2.0 g/L时其对酪氨酸酶的效果达80%,比红景天水提液的效果更好。Chiang等[39]研究表明红景天提取物可抑制小鼠黑色素细胞黑色素的合成和酪氨酸酶活性,可作为皮肤美白剂。本试验通过酪氨酸酶抑制实验和小鼠B16黑色素瘤细胞实验对未辐照和辐照红景天提取物的美白作用进行研究,发现辐照剂量为20 kGy时红景天提取物的美白效果最好。刘有停等[40]采用超声提取的方法制备红景天提取液,结果显示在质量分数为1.00%时,红景天提取液对酪氨酸酶和小鼠黑色素细胞合成黑色素的抑制率分别为为79.1%和39.0%,说明红景天提取液具有良好的美白功效,其结果与本试验相一致。王英存等[41]研究发现红景天提取液体积分数为0.125%时,其对DPPH自由基的清除率达到了71%;在体积分数为0.5%时,其对酪氨酸酶的抑制率为48%,同时,红景天提取物能够显著地减少小鼠B16细胞黑色素的生成,与本研究结果一致。

4 结论

与辐照前(辐照剂量为0 kGy)相比,不同剂量的60Co-γ射线辐照处理后,红景天提取物均具有良好的抗氧化活性及美白作用,且辐照剂量为20 kGy的红景天提取物抗氧化及美白效果最好。